Visualisering av IL-22-uttrykke lymfocytter Bruke Reporter Mus
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reporter mus har blitt mye brukt til å observere lokalisering av uttrykk for målrettede gener. Denne protokollen fokuserer på en strategi om å etablere en ny transgen reporter mus modell. Vi valgte å visualisere interleukin (IL) 22 genekspresjon fordi dette cytokinet har viktige aktiviteter i tarmen, hvor den bidrar til å reparere vev skadet ved betennelse. Rapportør systemer tilbyr betydelige fordeler i forhold til andre metoder for å identifisere produkter in vivo. I tilfellet av IL-22, hadde andre studier først isolert celler fra vev, og deretter re-stimulerte celler in vitro. IL-22, som normalt utskilles, ble fanget inne i cellene ved bruk av et medikament, og intracellulær farging ble brukt for å visualisere det. Denne metoden identifiserer celler i stand til å produsere IL-22, men det betyr ikke avgjøre om de gjorde det i vivo. Reporteren design inkluderer innsetting av et gen for en fluorescerende protein (tdTomato) inn i IL-22-gen i en slik way at den fluorescerende protein ikke kan bli utskilt, og derfor forblir innesperret i de produserende celler in vivo. Fluorescerende produsenter kan deretter visualiseres i vevssnitt eller ved ex vivo-analyse ved flowcytometri. Selve konstruksjonen Fremgangsmåte for reporter inkluderte recombineering et bakterielt kunstig kromosom som inneholdt IL-22-genet. Dette konstruerte kromosom ble deretter innført i musegenomet. Homeostatisk IL-22 reporter-ekspresjon ble observert i forskjellige muse vev, inkludert milt, thymus, lymfeknuter, Peyers lapp, og tarm, ved strømningscytometri-analyse. Kolitt ble indusert av T-celle (CD4 + CD45RBhigh) overføring, og reporter ekspresjon ble visualisert. Positive T-celler var først til stede i mesenteriske lymfeknuter, og da de samlet seg inne i lamina propria av distale tynntarm og tykktarm vev. Strategien bruker BACS ga god troskap reporter uttrykk i forhold til IL-22 expressjon, og det er enklere enn knock-in prosedyrer.
Introduction
Celletype-spesifikke uttrykk for reporter gener er nyttig å identifisere celler som aktivt uttrykker målet i vev under homeostatiske og forstyrrede stater. Den gjør det også for rensing av disse cellene, som fortsatt er levedyktig, for å studere de andre egenskapene. Rapportør mus er blitt benyttet i belyse virkningsmekanismen for spesifikke cytokiner, transkripsjonsfaktorer, og regulatoriske elementer. Tidligere strategier 1, 2, 3 er i stor grad avhengig av å banke reporteren inn i målet locus i musekromosomet, en tidkrevende og kostbar prosedyre. Således er en enklere metode for generering av rapportør mus ønskelig.
Cytokiner er en bred klasse av små, utskilte proteiner / peptider som regulerer immunresponser gjennom intercellular signalisering. Interleukin 22 (IL-22) er et cytokin med mange rapporterte aktiviteter, inkludert barriere fuksjon, reparere vev, og betennelse 4. Selv om IL-22 ble først oppdaget som en T-celle produkt 5, senere rapporter demonstrert sitt uttrykk i natural killer (NK) celler hos mennesker 6 og mus 7 og i andre klasser av medfødte lymfocytter 8. Til tross for omfattende observasjon av IL-22-produserende celler, visualisering av IL-22 tidligere krevde ex vivo stimulering og permeabilization til flekker med antistoffer. Derfor ville roman IL-22 reporter mus være et svært nyttig verktøy for å undersøke funksjonen av IL-22 i homeostatiske og patogene prosesser.
Her har vi utviklet en forenklet transgen reporter musemodell for å ta hensyn til de IL-22-produserende celler in vivo og in vitro. Ved hjelp av en BAC recombineering metode 9, innsatt vi den tdTomato cDNA-sekvensen med poly A signal-fragmenter inn i IL-22 locoss og erstattet ekson 1. De andre utranslaterte regioner, eksoner, og regulatoriske elementer ble ikke forstyrret, siden vi ønsker å etterligne den naturlige regulering av IL-22 så mye som mulig. Stedet for reporter innsettings forstyrrer signalsekvensen, noe som resulterer i akkumulering av reporter inne i produserende celler, i motsetning til IL-22 selv, som hurtig utskilles. Denne nye fremgangsmåten kan også brukes til generering av rapportør mus for andre utskilte proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 spiller en avgjørende rolle i medfødt vertens forsvar og vev ombygging. IL-22-produserende celler er blitt identifisert ex vivo ved intracellulær farging. Imidlertid gjenstår det fremdeles vanskelig å spore IL-22-ekspresjon i situ, enten i normal tilstand eller i inflammatoriske tilstander. Denne protokollen beskriver en ny fremgangsmåte for å utvikle et IL-22 reporter musemodell, noe som gjør det mulig å lokalisere rapportør-uttrykkende celler in vivo. Reportergenet som koder …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
Referências
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
