Os tripanossomas africanos cultivados in vitro sofrem variação antigênica em uma taxa baixa, de modo que as populações são compostas de parasitas que expressam um tipo de glicoproteína de superfície variante dominante (VSG) e uma pequena população de variantes "trocadas". Este protocolo descreve um método rápido para detectar e quantificar essas populações.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Trypanosoma brucei, um parasita protozoário que causa tripanossomíase africana humana e animal (conhecida como doença do sono e nagana, respectivamente) alterna entre um vetor tsé-tsé e um hospedeiro mamífero. Ele escapa do sistema imunológico do hospedeiro mamífero trocando periodicamente a glicoproteína de superfície densa e variante (VSG) que cobre sua superfície. A detecção de variação antigênica em Trypanosoma brucei pode ser complicada e trabalhosa. Aqui, apresentamos um método para quantificar o número de parasitas que 'mudaram' para expressar um novo VSG em uma determinada população. Os parasitas são primeiro corados com um anticorpo contra o VSG inicial e, em seguida, corados com um anticorpo secundário ligado a um cordão magnético. Os parasitas que expressam o VSG inicial são então separados do resto da população, passando os parasitas por uma coluna presa a um ímã. Os parasitas que expressam o VSG inicial dominante são retidos na coluna, enquanto o fluxo contém parasitas que expressam um novo VSG, bem como alguns contaminantes que expressam o VSG inicial. Essa população de fluxo contínuo é corada novamente com um anticorpo marcado com fluorescência contra o VSG inicial para rotular contaminantes e iodeto de propídio (PI), que rotula células mortas. Um número conhecido de contas de contagem absoluta que são visíveis por citometria de fluxo é adicionado à população de fluxo. A proporção de grânulos para o número de células coletadas pode então ser usada para extrapolar o número de células em toda a amostra. A citometria de fluxo é usada para quantificar a população de switchers contando o número de células PI negativas que não se coram positivamente para o VSG inicial dominante. A proporção de comutadores na população pode então ser calculada usando os dados de citometria de fluxo.
Introdução
O parasita protozoário, o Trypanosoma brucei, é um agente causador de doenças que afetam os seres humanos (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animais (via Trypanosoma brucei brucei) em toda a África Sub-Sahariana. Ele é transmitido para o hospedeiro mamífero através da saliva do vector mosca tsé-tsé. Ambos Humana e tripanossomíase Africano Animal causar uma carga económica grave em regiões endêmicas, e poucas drogas são disponíveis ou em desenvolvimento para o tratamento de qualquer doença. Compreender mecanismos de evasão imunitária é crítico para o desenvolvimento de drogas para a tripanossomíase. A varia....
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Protocolo
NOTA: Durante o procedimento, é necessário manter as células no gelo. media frias também devem ser utilizados por toda parte.
Colheita 1. Amostra
- Crescer Lister 427 tripanossomas tensão da corrente sanguínea até uma densidade de 0,5 - 1 milhão / ml. É melhor iniciar culturas com um pequeno número de parasitas. Girar 50 X 10 6 células / amostra durante 10 min a 1500 x g. Certifique-se de deixar 1 x 10 6 células em cultura para mais tarde usar controles de anticorpos como positivos e negativos.
NOTA: Este protocolo também pode ser usado em tripanossomas isolados de sangue animal (ver discussão para ma....
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Resultados
O método aqui descrito foi utilizado para demonstrar que as quebras de cadeia dupla no interior do local de expressão VSG aumentou o número de comutadores numa população 8. Aqui, mostramos resultados representativos de uma população de tripanossomas que têm sido igualmente induzidos para gerar uma ruptura de fita dupla no local expressão. Nós comparar estes tripanossomas para aqueles que não tenham sido induzidas a gerar uma ruptura de fita dupla. A Figura 1 m.......
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Discussão
No que diz respeito à técnica experimental, o componente mais importante do protocolo é manter todas as amostras frias. Tripanossomas internalizar muito rapidamente anticorpo ligado à sua superfície 9, mas este processo é dependente da motilidade, e não influencia o ensaio, enquanto as células são mantidas a 4 ° C. Todas as amostras devem sempre ser mantidos em gelo, e pipetagem deve ser feito rapidamente para minimizar a exposição ao ambiente C laboratório 25 °. Frio HMI-9 com soro deve estar disponível no i.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Nós gostaríamos de agradecer George Cross para o conselho geral sobre a biologia do tripanossoma. Este trabalho também foi apoiado por uma Fundação Bill e Melinda Gates concessão GCE para DS, a NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM e um NIH / NIAID (concessão # AI085973) para FNP. Agradecemos Galadriel Hovel-Miner para o uso da estirpe contendo o local de gene e reconhecimento I-SCEI.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| anticorpo anti-VSG não marcado | n/a | n/a | O anticorpo VSG é fabricado internamente |
| Anticorpo anti-VSG marcado com fluoróforo | n/a | n/a | O anticorpo VSG é fabricado internamente |
| HMI-9 Mídia | n/a | n/a | HMI-9 é fabricado internamente |
| Iodeto de propídio | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright contas de contagem absoluta | Thermofisher Colunas Scientific | C36950 | |
| LD | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| Ímã MACS | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Separador magnético MACS | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| adaptador de vórtice-60 | ThermoFisher citômetro de | AM10014 | |
| Coulter | n/a | ||
| software de análise de citômetro de fluxo | FloJo | n/a |
Referências
- Horn, D. Antigenic variation in African trypanosomes. Molecular & Biochemical Parasitology. 195 (2), 123-129 (2014).
- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
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Reimpressões e permissões
