की जांच<em> Trypanosoma ब्रुसे</em> चुंबकीय सक्रिय सेल छंटनी और प्रवाह cytometry द्वारा संस्करण सतह ग्लाइकोप्रोटीन स्विचिंग
Summary
African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of “switched” variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.
Abstract
Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have ‘switched’ to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.
Introduction
प्रोटोजोआ परजीवी, Trypanosoma ब्रुसे, रोगों कि मनुष्यों और जानवरों (Trypanosoma ब्रुसे ब्रुसे के माध्यम से) उप-सहारा अफ्रीका में (Trypanosoma ब्रुसे gambiense और Trypanosoma ब्रुसे रोडेसिएंस के माध्यम से) को प्रभावित की एक प्रेरणा का एजेंट है। यह ट्सेत्सी मक्खी वेक्टर के लार के माध्यम से स्तनधारी मेजबान को प्रेषित किया है। दोनों मानव और पशुओं अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस स्थानिक क्षेत्रों में एक गंभीर आर्थिक बोझ का कारण है, और कुछ दवाओं के उपलब्ध या विकास या तो बीमारी का इलाज करने के लिए कर रहे हैं। प्रतिरक्षा चोरी के तंत्र को समझना trypanosomiasis के लिए दवाओं के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। घने, variant सतह ग्लाइकोप्रोटीन (VSG) कोट कि परजीवी शामिल किया गया है की प्रतिजनी बदलाव प्राथमिक साधन है जिसके द्वारा टी ब्रुसे स्तनधारी एंटीबॉडी प्रतिक्रिया बचाव किया। VSG जीन के लगभग 2,000 वेरिएंट trypanosome जीनोम में मौजूद हैं, लेकिन केवल एक में से एक से किसी भी समय पर लिखित है ~ 15 एक्सप्रेशंससायन साइटों। व्यक्त VSG की 'स्विचिंग' या तो सक्रिय अभिव्यक्ति साइट में एक VSG जीन को कॉपी करके, या एक पहले से मूक अभिव्यक्ति साइट (1 में समीक्षा) के transcriptional सक्रियण द्वारा हो सकता है।
हालांकि बहुत काम में टी समझने प्रतिजनी बदलाव के लिए समर्पित किया गया है ब्रुसे, कारक है कि आवृत्ति स्विचन प्रभाव अभी भी खराब समझ रहे हैं। तारीख के अध्ययन इस तथ्य यह है कि जब स्विचिंग इन विट्रो में प्रसंभात्य होता है, स्विचिंग आवृत्तियों, बहुत कम हैं लगभग 10 6 कोशिकाओं 2 में 1 के आदेश पर द्वारा बाधा उत्पन्न की है। इस उपाय को एक दिया कारक बढ़ जाती है या, स्विचिंग आवृत्ति कम हो जाती है कि क्या के बाद से स्विचिंग पहली जगह में पता लगाने के लिए मुश्किल है, यह कठिन बना देता है। 2009 से पहले, एक दिया आबादी में switchers को अलग-थलग करने के लिए तरीके लंबा थे और श्रम गहन। इनमें प्रमुख VSG के खिलाफ प्रतिरक्षित चूहों के माध्यम से Trypanosomes passaging और फिर कटाई कोशिकाओंएक दिन बाद 3, या immunofluorescence 4,5 द्वारा कोशिकाओं के सैकड़ों की गिनती। एक और रणनीति के चयन पर निर्भर करता है दवा प्रतिरोध switchers 6 अलग-थलग करने के लिए। क्योंकि अफ्रीकी विट्रो में उगाया Trypanosomes आम तौर पर एक बड़ी आबादी के एक प्रमुख संस्करण है, और वैकल्पिक वेरिएंट व्यक्त switchers के एक बहुत छोटे आबादी को व्यक्त करने के बने होते हैं, हम प्रमुख, शुरू VSG के रूप में इस पत्र भर में प्रमुख संस्करण को देखें। ऐसा करने में, हम कोई रास्ता नहीं में इस प्रमुख संस्करण जनसंख्या में अन्य वेरिएंट की तुलना में अधिक से अधिक फिटनेस है कि संकेत करने के लिए चाहते हैं।
4 घंटा – यहाँ हम एक तरीका है कि मज़बूती से 3 में एक भी आबादी में एक गैर प्रमुख VSG व्यक्त Trypanosomes की संख्या उपाय कर सकते हैं का वर्णन है। इस विधि जब एक पता लगाने के लिए एक दिया आनुवंशिक हेरफेर या नशीली दवाओं के उपचार की आबादी में बंद कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है कि क्या चाहता है के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। बजाय करना व्यक्त कोशिकाओं की आबादी को मुक्त करने कीminant, दवाओं के माध्यम से VSG शुरू करने या प्रतिरक्षा तरह से, इन कोशिकाओं को पहली बार उन्हें प्रमुख VSG के खिलाफ एंटीबॉडी के लिए युग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ कोटिंग और फिर एक चुंबकीय स्तंभ पर उन्हें अलग से समाप्त हो जाते हैं। स्विच्ड आबादी तो प्रवाह के माध्यम से एकत्र की है और एक fluorophore लेबल विरोधी VSG एंटीबॉडी contaminants की पहचान करने के साथ फिर से सना हुआ है। मात्रा का ठहराव प्रत्येक नमूने के लिए पूर्ण गिनती मोतियों की एक निर्धारित संख्या को जोड़ने इतना है कि कोशिकाओं के लिए मोती के अनुपात निर्धारित किया है और जनसंख्या 7 में switchers की संख्या यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा हासिल की है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रयोगात्मक तकनीक के लिए सम्मान के साथ, प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण घटक ठंड सभी नमूनों रखे हुए है। Trypanosomes बहुत तेजी से उनकी सतह 9 के लिए बाध्य एंटीबॉडी भली, लेकिन इस प्रक्रिया गतिशीलता निर्भर है, और ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम trypanosome जीव विज्ञान पर सामान्य सलाह के लिए जॉर्ज क्रॉस स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम भी डी एस, एम आर एम के लिए एक NSF ग्रेजुएट रिसर्च फैलोशिप (डीजीई-1325261) और एक एनआईएच / NIAID (अनुदान # AI085973) FNP करने के लिए एक बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन GCE अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। हम मैं-SCEI जीन और मान्यता साइट युक्त तनाव के उपयोग के लिए Galadriel झोंपड़ी-खान धन्यवाद।
Materials
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
Referências
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- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
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