Hier melden wij een snelle en efficiënte gen-editing methode op basis van RMCE in de AAVS1 locus van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), die verbetert eerder beschreven systemen. Met deze techniek kan isogene lijnen snel en betrouwbaar worden gegenereerd voor goede vergelijkende studies vergemakkelijkt-gemedieerde transgenese onderzoek met hPSCs.
Zelfs met de revolutie van-gen-targeting technologie onder leiding van CRISPR-Cas9, genetische modificatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) is nog steeds tijdrovend. Vergelijkende studies dat recombinant lijnen met transgenen geïntegreerd in veilige haven loci gebruik kan maken van benaderingen die gerichte plaatsspecifieke recombinasen, zoals Cre of FLPe gebruiken die sneller en minder gevoelig voor off-target effecten. Dergelijke werkwijzen zijn beschreven, hoewel ze niet significant beter presteren gen targeting in de meeste aspecten. Het gebruik van zink-finger nucleasen, wij eerder een master-cellijn in de AAVS1 locus van hPSCs dat een GFP-hygromycine-tk tot expressie cassette bevat, geflankeerd door heterotypische FRT sequenties. Hier hebben we de procedures te beschrijven FLPe-recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) uit te voeren met behulp van deze lijn. De master cell lijn wordt getransfecteerd met een RMCE donor vector, die een promoter puromycineresistentie bevat, en met FLPe recombinase. Toepassing van zowel een positieve (Puromycine) en negatieve (FIAU) selectie programma leidt tot de selectie van RMCE zonder willekeurige integraties. RMCE genereert volledig gekarakteriseerde pluripotente polyklonale transgene lijnen 15 d met 100% rendement. Ondanks de recent beschreven beperkingen van de AAVS1 locus, het gemak van het systeem maakt de weg vrij voor HPSC transgenese in isogene instellingen is nodig voor vergelijkende studies, en maakt semi-high-throughput genetische screens voor winst / verlies van functie-analyse die anders zouden zijn zeer tijdrovend.
Gerichte genoom recombinatie is snelle vooruitgang mogelijk gemaakt op vele terreinen van onderzoek. Bij muizen is de synergie tussen genoom bewerken en stamcelonderzoek toegestaan voor een beter begrip van het complex mechanisme van gen-functie en genregulatie. Een dergelijke vooruitgang verwacht in menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) als goed, hoewel het voor vele jaren sinds de eerste isolatie van menselijke embryonale stamcellen (hESC 's), en later de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), gen editing is een technische hindernis vormde . Recente ontwikkelingen in het genoom van techniek met behulp van doelgerichte nucleasen-Zinc Finger Nucleases (ZFNs), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALEN) of geclusterde regelmatig interspaced korte palindroom herhalingen /-CRISPR geassocieerd eiwit 9 (CRISPR / Cas9) hebben ons om deze te overwinnen moeilijkheden, het maken van gerichte recombinatie een efficiënt proces 1-3.
Specifieke loci in de mouse genoom dat stabiele, betrouwbare en alomtegenwoordige transgenexpressie in de afwezigheid van bijwerkingen zoals Rosa26, Hprt1 of COL1A1 toestaan geworden essentiële hulpmiddelen bij het uitvoeren van genetische studies. Safe harbor loci mogelijk vergelijkbare analyse tussen de verschillende lijnen van muizen in isogene contexten. Dit kan niet worden bereikt met standaard willekeurige integratie werkwijzen die zijn geassocieerd met bekende beperkingen zoals mutagenese, dosisafhankelijke effecten of bonte transgenexpressie. Gene bewerken gemak en flexibiliteit veilige haven loci wordt verhoogd door het gebruik van plaatsspecifieke recombinasen zoals gerichte Cre of flippase (FLPe), dat specifiek herkennen doelsequenties (loxP of FRT respectievelijk) en efficiënt katalyseren recombinatie tussen identieke doelen. Als gevolg van deze kenmerken, recombinase gemedieerde gen bewerken met behulp van loxP of FRT sequenties in vooraf geïntegreerde veilige haven loci is een gemeenschappelijk instrument dat wordt gebruikt in de muis transGenesis. Naast cassette inbrengen of excisie bemiddelde tussen identieke doelsequenties, het gebruik van incompatibele loxP of FRT-plaatsen maakt recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) 4.
Bij de mens probeert te identificeren veilige haven loci zijn uitgevoerd. De muis orthologe HPRT Ondanks de associatie met de verlies-van-functie Lesch-Nyhan syndroom en ROSA26 zijn gericht in hPSCs. HPRT gemeld snel zwijgen transgene expressie in ESC en, zoals ROSA26, het vermogen om transgenexpressie te ondersteunen in terminaal gedifferentieerde cellen werd niet onderzocht 5-7. Omdat een homozygote nul-mutatie van het CCR5-gen lijkt goed verdragen bij mensen, werd de waarde veilige zone bepaald. CCR5 werd gericht en aan stabiele transgene expressie houden in verschillende humane cellijnen, waaronder SER 8,9. Echter,de laatste werd niet aangetoond op klonale niveau tijdens langetermijnkweek en alomtegenwoordige transgenexpressie werd niet aangetoond in gedifferentieerde nageslacht van de drie kiembladen. AAVS1, de natuurlijke integratieplaats van het adeno-geassocieerde virustype 2 (AAV), werd getest in hESC 's goed ook, want van de gerapporteerde resistentie tegen transgene zwijgen 10. Later, veel groepen gebruikte AAVS1 locus en beschreven stabiele transgenexpressie in ongedifferentieerde hPSCs, alsmede in hun gedifferentieerde nageslacht van alle weefsels, zowel in vitro als in vivo 2,8,11,12. De recente resultaten niettemin nuanceren deze bevindingen, omdat de AAVS1 locus bleek variabele transgene remming in vitro uitoefenen ongedifferentieerde hESC 's en in hepatocyte nageslacht 13.
Extra screening studies met behulp van willekeurige integratie benaderingen en methoden om te bepalen enkel exemplaar integratie gericht op geno vindenmic integratieplaatsen bestand tegen transgene silencing tijdens hPSCs expansie en differentiatie 14,15. Over het algemeen, tot nu toe, geen genomische site is volledig gevalideerd als een veilige haven in hPSCs en hun nageslacht; identificatie van een geschikte plaats voor alomtegenwoordige stabiele transgene expressie, niet alleen in hPSCs maar ook in hun gedifferentieerde nakomelingen in vitro pt in vivo, nog worden opgelost. Van alle onderzochte loci en ondanks zijn beperkingen, blijft AAVS1 de best gekarakteriseerd en meest gebruikte in stamcelonderzoek.
RMCE is met succes uitgevoerd in hPSCs uitgevoerd in een aantal van deze loci 6,7,14,16, met behulp van vooral Cre recombinase, zelfs als er aanwijzingen zijn dat FLPe is efficiënter dan Cre 17. In al deze gevallen werd een positief resistentie cassette voor de selectie van recombinante kolonies. Hoewel succesvol, zijn deze procedures geen technische vooruitgang ten opzichte van standaard gen- vormenediting procedures met behulp van ZFNs, Talens of CRISPR / Cas9, als één antibioticum selectieprocedure sluit niet uit willekeurige integraties en vereist kolonie screening om correct gerichte klonen te identificeren.
In deze procedure beschrijven we methoden RMCE voeren in hPSCs in de AAVS1 locus met een combinatie van positieve (binnen de inkomende cassette) en negatieve (binnen de vooraf geïntegreerde cassette) selecties die zorgen voor het genereren van polyklonale transgene lijnen in ± 15 dagen 100% rendement en vrij van willekeurige integratie evenementen. Daarom is deze methode vertegenwoordigt vooruitgang ten opzichte van momenteel beschreven RMCE technologieën in hPSCs.
Gene bewerken methoden in veilige haven loci blijft een essentieel instrument om transgenese ontwikkelen hPSCs. Hoewel de veilige haven karakter van AAVS1 is onlangs ondervraagd voor sommige toepassingen 13,18, blijft dit locus momenteel de beste gekenmerkt mens afgeleide cellijnen. Bewustwording van de beperkingen in hPSCs kan helpen om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom wordt AAVS1 nog steeds verwacht dat een bruikbare site, bijvoorbeeld, voor gain en verlies-van-functie studies of induceerbare / constitutieve expressie van factoren die een isogene context en tussen bepaalde genetische achtergrond vereist.
De AAVS1 locus is doelwit van vele groepen met behulp van ZFNs, TALEN of CRISPR / Cas9 1,2,19. Deze nucleasen aanzienlijke verhoging van de efficiëntie van homologe recombinatie in een bepaalde locus. De werkwijze voor het screenen en gekarakteriseerd doelgericht klonen, zonder willekeurige integrantsoen en pluripotentie behouden en genoomintegriteit kan tot 3 maanden (met behulp van geoptimaliseerde gen-editing tools) (figuur 3). De laatste twee kunnen worden veroorzaakt door mogelijke mutaties gegenereerd door off-target nuclease activiteit. Het RMCE systeem hier gebruikt, biedt echter een snelle, efficiënte en elegante methode om dit doel te bereiken twee weken, eenmaal recombinase-specifieke doelsequenties in de vooraf geïntegreerde AAVS1 locus. Het gebruik van positieve / negatieve selectie en een passende selectie programma zijn de belangrijkste factoren die bijdragen aan de vereenvoudiging van gen-editing in de AAVS1 locus door RMCE.
Genotypische karakterisatie van nieuwe transgene lijnen wordt aanzienlijk verminderd (geen klonale screening nodig) en karakterisering verbonden met off-target nuclease activiteit overbodig gemaakt door de specificiteit van FLPe voor FRTS. De kwalificatie kan ook in routine RMCE experimenten worden verminderd door het aantonen van devolledig verlies van GFP-expressie van de meester-cellijn (Figuur 2A), want vol cassette uitwisseling en het ontbreken van willekeurige integratie zijn reeds voldoende aangetoond door PCR (Figuur 2B) en Southern blot 13. Het gebruik van positieve / negatieve selectie vormt ook het belangrijkste verschil met de eerdere verslagen. Verscheidene groepen die eerder RMCE beschreven hPSCs, hetzij in de AAVS1 of andere loci, gebruikt slechts één positieve selectiestap 7,14,16. Dit betekent niet een grote technische voordeel ten opzichte van gen-editing uitgevoerd met nucleasen vormen, omdat kolonie screening moet eveneens worden uitgevoerd om de juiste integratie en de afwezigheid van willekeurige integratie aan te tonen op het klonale niveau.
Het gebruik van deze RMCE systeem in meerdere hESC / iPSC lijnen vereist preintegration van de beschreven FRT-bevattende cassette in de AAVS1 locus van iedere onafhankelijke lijn. Echter, eenmaal uitgevoerd,de snelheid en eenvoud biedt de mogelijkheid om semi-high throughput genetische screens in bepaalde isogene instellingen daarboven anders vermeld applicaties zou technisch zeer tijdrovend zijn. Bovendien worden alle RMCE vectoren geconstrueerd in de pZ AAVS1-gen richtende vector die voor de locus met ZFNs doel, maar Talens of CRISPR / Cas9 gerapporteerd. De RMCE vector van dualiteit is zeer nuttig om meerdere regels voor een bepaald transgen in hPSCs met of zonder FRT genereren. Bijvoorbeeld, een hit succesvol in een bepaalde genetische screen door RMCE uitgevoerd aangetoond zou idealiter moeten worden getest in meerdere HPSC lijnen naar de resultaten te bevestigen. Aangezien meervoudige RMCE-meester geschikte cellijnen kunnen direct gene targeting van de treffer gebruik nucleasen worden uitgevoerd. Het nut van het duale karakter van de RMCE vectoren is bewezen door onze fractie 20. In deze studie werd correctie gen in de patiënt-afgeleide uitgevoerdFrontotemporale dementie (FTD) iPSCs dat een mutatie waardoor progranuline (PGRN) expressie tekort dragen. Gen complementatie door ZFNs-gemedieerde insertie in de AAVS1 locus van een cassette die PGRN niveau hersteld, corrigeerde de defecte fenotype in corticogenesis geassocieerd met de aanwezigheid van de mutatie. Daarnaast werd een vergelijkbare lijn die door RMCE in WT hESCs worden gebruikt als controle voor exogene PGRN expressie.
Aangezien recombinante kolonies, controleer transfectie efficiëntie van de RMCE donorvector. Transfectie efficiënties hoger dan 30% geven de bovenstaande resultaten. Lagere transfectie efficiënties afnemen recombinatie efficiency. Tenslotte heeft de RMCE systeem gegenereerd in de AAVS1 locus, maar is toepasbaar op elk ander locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |