कम सेल मंदिर विश्लेषण के लिए संख्या के साथ नमूना तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) सेलुलर संगठन और फैटी की जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, इस तरह hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) के रूप में दुर्लभ सेल आबादी, विशेष रूप से निलंबन में कोशिकाओं के मंदिर विश्लेषण, नमूना तैयार करने के दौरान एक उच्च सेल नंबर की आवश्यकता के कारण सीमित रहता है। वहाँ दुर्लभ नमूनों से मंदिर विश्लेषण के लिए कुछ cytospin या monolayer दृष्टिकोण हैं, लेकिन इन तरीकों कोशिकाओं की सीमित संख्या से महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने में विफल है। इधर, मंदिर के अध्ययन में नमूना तैयार करने के लिए एक वैकल्पिक और उपन्यास दृष्टिकोण दुर्लभ सेल आबादी है कि मात्रात्मक विश्लेषण में सक्षम बनाता है के लिए वर्णित है।
एक अपेक्षाकृत कम सेल नंबर, यानी, 10,000 एचएससी, सफलतापूर्वक मंदिर विश्लेषण कोशिकाओं को आमतौर पर मंदिर अध्ययन के लिए इस्तेमाल के लाखों लोगों की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था। विशेष रूप से, इवांस नीले धुंधला paraformaldehyde-glutaraldehyde के बाद किया गया था (पीएफए-जीए) निर्धारण छोटे सेल PEL कल्पना करने के लिएचलो, जो agarose में embedding मदद की। कई कोशिकाओं के समूहों अति पतली वर्गों में मनाया गया। कोशिकाओं को एक अच्छी तरह से संरक्षित आकृति विज्ञान था, और Golgi जटिल और कई माइटोकॉन्ड्रिया की अल्ट्रा संरचनात्मक विवरण दिखाई दे रहे थे। यह कुशल, आसान और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल एक कम सेल नंबर से नमूना तैयार करने की अनुमति देता है और सीमित जैविक नमूने से दुर्लभ सेल आबादी पर गुणात्मक और मात्रात्मक मंदिर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
कोशिकाओं की अल्ट्रा संरचनात्मक और उप organelle विवरण मुख्य रूप से संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) ऊतकों या सेल छर्रों 1,2 से अध्ययन से खुलासा किया गया है। ऊतकों की ठोस टुकड़ों को आसानी से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के अध्ययन के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, मंदिर का विश्लेषण करती है 1,3 निलंबन में कोशिकाओं पर चुनौतीपूर्ण बने हुए हैं और उच्च सेल नंबर, यानी, कोशिकाओं के लाखों लोगों की जरूरत है। इस वजह से, निलंबन में दुर्लभ सेल आबादी के अल्ट्रा संरचनात्मक विश्लेषण, जैसे, hematopoietic स्टेम कोशिकाओं (एचएससी), आसानी से मूल्यांकन नहीं कर रहे हैं। cytospin या monolayer तरीकों का उपयोग दुर्लभ नमूनों से मंदिर विश्लेषण के लिए कई प्रयासों कोशिकाओं की सीमित संख्या से महत्वपूर्ण मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने में विफल है। इस प्रकार, एक उच्च सेल नंबर की आवश्यकता इस शक्तिशाली उपकरण के उपयोग के दुर्लभ सेल आबादी के subcellular ultrastructural विवरण को समझने के लिए सीमा।
सेल की एक सीमित संख्या के साथ मंदिर अध्ययन के लिए एक प्रमुख सीमानिलंबन में प्रसंस्करण के लिए कोशिकाओं का स्थानीयकरण है और इस प्रकार, विशेष रूप से छोटे आकार के साथ सीमित कोशिकाओं से मंदिर के अध्ययन चुनौतीपूर्ण रहेगा। कई वैकल्पिक तरीकों इस सीमा मुकाबला करने के लिए अपनाया गया है: बीएसए / bisacrylamide (बीएसए बीए) सेल निलंबन की मध्यस्थता polymerization, एक डाई के साथ कोशिकाओं उन्हें coverslips सहित एक पतली फिल्म के समर्थन पर दिखाई बनाने के लिए की धुंधला हो जाना, और मंदिर cytospin तैयारियों 4-6 से विश्लेषण करती है। हालांकि, बहुत सीमित सफलता हासिल की थी, के रूप में बहुत कुछ कोशिकाओं अल्ट्रा सेक्शनिंग के बाद वर्गों में पाए गए। विरल कोशिकाओं की पहचान की प्रमुख चुनौती बनी रहती है क्योंकि सेल monolayer ज्यादातर सेक्शनिंग के लिए जम जेल में अदृश्य रहता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के cytospin तैयारी सेल प्रसार और सेल संरचना की कमजोरी के कारण उनके सेलुलर संगठन बदल सकता है। इसलिए, इन निहित कमियों के एक उपन्यास दृष्टिकोण अधिक के साथ दुर्लभ सेल आबादी से मंदिर अध्ययन करने के लिए वारंटस्थिरता। इस समस्या को दूर करने के लिए, हम दुर्लभ सेल आबादी 7 से मंदिर के अध्ययन के लिए एक उपन्यास और वैकल्पिक नमूना तैयार विधि का वर्णन किया है।
यहाँ, हम लगातार गुणात्मक और मात्रात्मक परिणाम के साथ दुर्लभ जैविक नमूने से मंदिर प्रदर्शन करने के लिए एक कुशल नमूना तैयार प्रोटोकॉल की रिपोर्ट। इवांस नीले धुंधला कम संख्या कोशिकाओं, यानी, 10,000 अस्थि मज्जा hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं है कि अन्यथा अदृश्य बना रहा होगा से एक छोटे से सेल गोली स्थानीय बनाना निर्धारण के बाद किया गया था, और गोली से पहले निर्जलीकरण और राल embedding प्रक्रियाओं agarose में एम्बेडेड था। इस विधि कोशिकाओं को एक साथ समूहों और फैटी और hematopoietic स्टेम कोशिकाओं की subcellular संगठन (लिन के रूप में पहचान – SCA-1 + C-किट + FLT3 – CD34 -; एचएससी) के कुशल विश्लेषण में सक्षम बनाता है, एक दुर्लभ 0.2 – 0.5% सेल की आबादी अस्थि मज्जा में। इस प्रयोगात्मक समर्थकtocol अल्ट्रा संरचनात्मक अध्ययन करते हैं और कई दुर्लभ लेकिन अत्यधिक महत्वपूर्ण आबादी पर मात्रात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि को कम सेल नंबर पर मंदिर विश्लेषण में सक्षम बनाता है, इवांस नीले धुंधला का उपयोग और agarose निर्जलीकरण, राल एम्बेडिंग के दौरान एक छोटे से सेल गोली स्थानीय बनाना embedding और प्रक्रियाओं सेक्शनिंग द्वारा। ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
Referências
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