TEM分析のための低細胞数とサンプル調製のための代替的アプローチ
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
透過型電子顕微鏡（TEM）は、細胞、組織及び微細構造の詳細を提供します。しかしながら、このような造血幹細胞（HSC）などの希少細胞集団、懸濁液中で特に細胞のTEM分析は、によりサンプル調製時の高い細胞数の要件に制限されたままです。そこ希少試料からのTEM分析のためのいくつかのサイトスピンまたは単層のアプローチがありますが、これらのアプローチは、限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。ここでは、TEM研究における試料調製のための代替的なおよび新規なアプローチは、定量的な分析を可能にする希少細胞集団のために記載されています。
比較的低い細胞数、 すなわち10,000のHSCは、正常通常はTEM研究のために使用される細胞の数百万人に比べTEM分析に使用しました。具体的には、エバンスブルー染色は、小さな細胞画素を可視化するために、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（PFA-GA）固定後に実施しましたアガロースに包埋促進する、しましょう。多数の細胞のクラスターは、超薄切片において観察されました。細胞はよく保存形態を有し、かつゴルジ複雑で、いくつかのミトコンドリアの超微細構造の詳細が表示されていました。この効率的で、簡単で再現可能なプロトコールは、低細胞数からの試料調製を可能にし、限られた生物学的サンプルから稀な細胞集団の定性的および定量的なTEM分析のために使用することができます。
Introduction
細胞の超構造的およびサブオルガネラ詳細は主に組織または細胞ペレット1,2の透過型電子顕微鏡（TEM）の研究によって明らかにされています。組織の固体片を容易に電子顕微鏡研究のために利用することができます。しかし、TEMは、懸濁液中の細胞に1,3を分析した細胞の数百万、厳しい状況が続くと高い細胞数を必要とする、 すなわち 。このため、懸濁液中の希少な細胞集団の超構造解析は、 例えば、造血幹細胞（HSC）は、容易に評価されません。サイトスピンまたは単層のアプローチを使用して、不足して試料からのTEM解析のために複数の試みは限られた数の細胞から重要な定量的なデータを取得するために失敗します。このように、高い細胞数の要件は、希少な細胞集団の細胞内超微細詳細を理解するために、この強力なツールの使用を制限します。
セルの数が限られているTEM研究のためのキーの制限懸濁液中のsが処理のために、細胞の局在であり、従って、特に小さいサイズの制限された細胞由来のTEM調査は困難なままです。いくつかの代替的なアプローチは、この制限に対抗するために採用されている：細胞懸濁液のBSA /ビスアクリルアミド（BSA-BA）媒介重合、細胞の染色を染料でカバースリップを含む薄いフィルム支持体上にそれらが表示されるように、 およびTEMは、サイトスピン調製物4-6から分析します。非常に少数の細胞が超切片後の節で見たようしかし、非常に限られた成功は、達成されました。細胞単層は、切片のために固化したゲル中の大部分が見えないままなので、スパース細胞を同定するの主要な課題は解消されません。さらに、細胞のサイトスピン調製を伴う細胞拡散、細胞構造の脆弱性への細胞の組織を変化させることができます。したがって、これらの固有の欠点は、より稀な細胞集団からのTEM調査を実行するための新規なアプローチを正当一貫性。この問題を克服するために、我々は、まれな細胞集団7からTEM研究のための新規かつ代替サンプル調製方法を記載しています。
ここでは、一貫性の定性的および定量的な結果と希少な生物学的サンプルからTEMを実行するための効率的なサンプル調製プロトコルを報告しています。エバンスブルー染色は、そうでなければ見えないままであったであろう数が少ない細胞、 すなわち 、万骨髄の造血幹細胞および前駆細胞から小さな細胞ペレットを局在化するために固定した後に行われた、そしてペレットを脱水し、樹脂包埋工程の前に、アガロースに包埋しました。この方法は、一緒に細胞をクラスタ化し、超微細構造と（林として識別– SCA-1 +のc-kit +のFlt3 – CD34 – ; HSC）造血幹細胞の細胞内、組織の効率的な解析が可能、稀0.2から0.5パーセントの細胞集団を骨髄インチこの実験的なプロトコールは、超構造研究を行うのに有用であると多くのまれではあるが非常に重要な集団の定量的な結果を得ることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法では、脱水中に小さな細胞ペレットをローカライズするために埋め込むエバンスブルー染色し、アガロースを用いて樹脂の埋め込みやプロセスを区画することにより、低細胞数のTEM分析を可能にします。重要なことは、それが一緒に細胞塊を維持し、データの定量化のための複数のセルを検査することが望ましい細胞の超構造を保存します。
TEM試験では、細胞?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
Referências
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