Une approche alternative pour la préparation de l'échantillon avec une faible Nombre de cellules d'analyse TEM
Summary
Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.
Abstract
microscopie électronique à transmission (MET) fournit des détails sur l'organisation cellulaire et ultrastructure. Cependant, l'analyse TEM des populations de cellules rares, en particulier les cellules en suspension telles que des cellules souches hématopoïétiques (CSH), reste limitée en raison de l'exigence d'un grand nombre de cellules lors de la préparation de l'échantillon. Il y a quelques cytocentrifugation ou monocouche approches pour l'analyse TEM à partir d'échantillons rares, mais ces approches ne parviennent pas à obtenir des données quantitatives significatives du nombre limité de cellules. Ici, une approche alternative et novatrice pour la préparation d'échantillons dans les études TEM est décrit pour les populations de cellules rares qui permet une analyse quantitative.
Un certain nombre de cellules relativement faible, à savoir, 10.000 CSH, a été utilisé avec succès pour l' analyse TEM par rapport aux millions de cellules généralement utilisées pour les études de TEM. En particulier, Evans coloration au bleu a été réalisée après paraformaldéhyde-glutaraldéhyde (PFA-GA) fixation de visualiser le pel cellulaire minusculelaisser, ce qui a facilité l'intégration dans l'agarose. Clusters de nombreuses cellules ont été observées dans les sections ultra-minces. Les cellules ont une morphologie bien conservé, et les détails ultra-structure des mitochondries complexes et plusieurs Golgi étaient visibles. Ce protocole efficace, simple et reproductible, permet la préparation d'échantillons à partir d'un numéro de cellule faible et peut être utilisé pour l'analyse TEM qualitative et quantitative sur les populations de cellules rares à partir d'échantillons biologiques sont limitées.
Introduction
Détails ultra-structuraux et sous-organelles de cellules ont principalement été révélée par microscopie électronique à transmission (MET) des études de tissus ou des culots cellulaires 1,2. des morceaux solides de tissus peuvent être facilement utilisés pour des études de microscopie électronique. Cependant, TEM analyse 1,3 sur des cellules en suspension restent difficiles et nécessitent le nombre de cellules élevées, à savoir, des millions de cellules. De ce fait , les analyses structurelles des ultra-populations de cellules rares en suspension, par exemple, des cellules souches hématopoïétiques (CSH), ne sont pas facilement évalués. Plusieurs tentatives d'analyse TEM à partir d'échantillons rares en utilisant cytocentrifugation ou monocouche approches ne parviennent pas à obtenir des données quantitatives significatives du nombre limité de cellules. Ainsi, l'exigence d'un nombre élevé de cellules limite l'utilisation de cet outil puissant pour comprendre les détails ultrastructuraux subcellulaire des populations de cellules rares.
Une limitation clé pour les études TEM avec un nombre limité de celluless en suspension est la localisation des cellules de traitement et donc, les études TEM provenant de cellules limitées avec en particulier les petites tailles restent difficiles. Plusieurs approches alternatives ont été adoptées pour contrer cette limitation: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) de polymérisation médiée de la suspension cellulaire, la coloration des cellules avec un colorant pour les rendre visibles sur un support de film mince comprenant des lamelles, et TEM analyse à partir de préparations de cytocentrifugation 4-6. Cependant, le succès très limité a été atteint, que très peu de cellules ont été trouvées dans les sections après ultra-tronçonnage. Le principal défi de l'identification des cellules rares persiste parce que la monocouche cellulaire reste la plupart du temps invisible dans le gel solidifié pour sectionner. En outre, la préparation Cytospin de cellules peut modifier leur organisation cellulaire en raison de l'étalement cellulaire et la fragilité de la structure cellulaire. Par conséquent, ces inconvénients inhérents justifient une nouvelle approche pour réaliser des études de TEM à partir de populations de cellules rares avec pluscohérence. Pour surmonter ce problème, nous avons décrit un procédé nouveau et de préparation d'échantillons alternative pour les études TEM de populations de cellules rares 7.
Nous rapportons ici un protocole de préparation d'échantillon efficace pour effectuer TEM à partir d'échantillons biologiques rares avec des résultats qualitatifs et quantitatifs cohérents. Evans coloration au bleu a été réalisée après la fixation de localiser un culot cellulaire minuscule à partir de cellules de faible nombre, à savoir, 10.000 moelle osseuse souches hématopoïétiques et des cellules progénitrices qui, autrement , sont restés invisibles, et le culot a été incorporé dans l' agarose avant que les processus de déshydratation et de résine enrobage. Cette méthode pôles de cellules ensemble et permet une analyse efficace de l'ultrastructure et de l' organisation subcellulaire des cellules souches hématopoïétiques (identifié comme Lin – Sca-1 + c-Kit + Flt3 – CD34 -; HSC), rare 0,2 – population de cellules à 0,5% dans la moelle osseuse. Cette pro expérimentaletocol peut être utile pour réaliser des études ultra-structurelles et obtenir des résultats quantitatifs sur de nombreuses populations rares mais très importants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode permet une analyse TEM sur un faible nombre de cellules, en utilisant Evans coloration bleu et agarose enrobage pour localiser une pastille de cellules minuscules lors de la déshydratation, enrobage de résine et les processus sectionner. Surtout, il maintient ensemble des agrégats de cellules et la cellule conserve l'ultra-structure, qui est souhaitable d'examiner de multiples cellules pour la quantification des données.
Dans les études TEM, une boulette cellulair…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).
Materials
| Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 15713 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln | Electron microscopy Sciences | 16350 | CAUTION Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood. |
| Cacodyladate buffer | Electron microscopy Sciences | 12300 | Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4°C. CAUTION Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Low melting agarose | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Osmium tetraoxide | Electron microscopy Sciences | 19130 | 1 gm in 50 ml of 0.1M Cacodyladate buffer to make 2% OsO4 stock, CAUTION Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood. |
| LX-112 Embedding Kits (LADD®) | |||
| DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride) | LADD | 21340 | Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30 |
| NMA (Nadic methyl anhydride) | LADD | 21350 | |
| Epoxy Resins Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | CAUTION Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood. |
| DMP-30 (2,4,6 -Tri(dimethylaminomethyl)phenol) | LADD | 21370 | |
| Reynolds lead citrate (EM Stain II) | Leica | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. | |
| Uranyl acetate (EM Stain I) | Leica | 8072820 | CAUTION Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes. |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composition: NaCl, NaHCO3, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate etc. For for details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| Pyramid tip mold | Ted Pella | 10585 | |
| mounting cylinders | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtome | (Leica EM UC7) | ||
| 200 mesh grids (nikil) | Electron microscopy Sciences | G-200 Ni | |
| Electron Microscope | Hitachi model H-7650 | ||
| Image capture engine software | AMT-600 | ||
| 35 mm plastic petri dishes | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super glue Cyanoacrylate | Electron microscopy Sciences | 72588 | |
| Razor blades | |||
| Glass scintillation vials | Fisher scientific | 03-337-14 | |
| Glass slides | |||
| Eyelash tool | |||
| Metal Loop tool |
Referências
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