The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum zijn solitaire bodem levende amoeben die zich voeden met bacteriën en andere micro-organismen, die door fagocytose worden genomen. Het heeft een unieke en opmerkelijke life cycle dat een belangrijk gebied van onderzoek sinds zijn ontdekking 1 is geweest. De vroege belangstelling meercellige ontwikkeling 2 en de moleculaire basis van chemotaxis 3 werd snel aangevuld met studies gericht op celmotiliteit, celpolariteit, aangeboren immuniteit. Bovendien, D. discoideum werd geïntroduceerd als een modelsysteem voor biomedisch onderzoek 4,5.
Onlangs hebben we vastgesteld D. discoideum als een nieuw systeem om de proteïne kwaliteitscontrole (PQC) systeem 6,7 bestuderen. Het proteoom is verrijkt in aggregatie-gevoelige prion-achtige eiwitten, die een uitdaging om proteïne kwaliteitscontrole 8 vormt. Om te onderzoeken of D. discoideum heeft speciale moleculaire mechanismen zijn sterk ag controle ontwikkeldCongregatie vatbaar proteoom, bestudeerden we het gedrag van de aggregatie-gevoelige marker eiwitten zowel in normale groeiomstandigheden en tijdens stress. Stresscondities, zoals hittestress, kan worden gebruikt om de snelheid van eiwit misfolding 9 verhogen. Daarom hebben we gezocht naar een systeem waarbij we temperatuurveranderingen konden veroorzaken en tegelijkertijd volgen het gedrag van de marker-eiwitten. Hiervoor combineerden we levende cellen beeldvorming met Peltier-verwarmings- behulp van een thermische trap inzetstuk (koelkamer). Deze methode verkregen we een constante en gelijkmatige temperatuur te handhaven en een snelle en toch nauwkeurige temperatuurverandering induceren.
Levende cellen beeldvorming wordt gebruikt om een verscheidenheid van biologische processen in D. bestuderen discoideum. Deze benadering voor twee belangrijke beperkingen. Ten eerste, de cellen een grote beweeglijkheid te geven en de neiging te migreren van het gezichtsveld, dus het volgen van individuele cellen vereist vaak beeldvorming van een groot gebied. De cel mobiliteitverminderd met agar overlay 10, maar deze zijn niet geschikt voor langdurige beeldvorming door een daling in levensvatbaarheid. Ten tweede, D. discoideum cellen een bijzonder hoge gevoeligheid voor foto-toxiciteit, waardoor celronding en mitose 11. Vorige protocollen deze kwestie door de toevoeging van ascorbaat als een radicale scavenger en vermindering van de blootstelling tijden 12. De laatste kan kritisch zijn als het eiwit van interesse tot expressie wordt gebracht op lage niveaus en vertoont een zwak fluorescentiesignaal. De auteurs stellen ook voor om een constante temperatuur van 21 ° C te bieden, hetzij door beeldvorming in een kamer met airconditioning of met behulp van temperatuur-gecontroleerde incubatie dozen, die het doel en de microscoop podium 12 dekken.
We beschrijven een werkwijze met een verbeterde temperatuurregeling door een koelkamer ingesteld op 23 ° C. Tijdens het afbeelden van onze set-up verhoogt aanzienlijk de weerstand van de foto-toxiciteit. Hetmaakt het gebruik van hogere blootstelling en hogere excitatie lichtintensiteiten. Dit is met name van belang tijdens de time-lapse imaging, zoals de tijdsintervallen moeten zorgvuldig afgewogen tegen het aantal posities in beeld gebracht en de belichtingstijd gebruikt te worden. De mogelijkheid om het aantal afgebeelde posities verhogen maakt ook de dekking van een groter beeldgebied en vergemakkelijkt het bijhouden van individuele cellen gedurende een langere periode.
De hier beschreven protocol kan worden gebruikt om het gedrag van een bepaalde proteïne van belang te bestuderen in reactie op door warmte opgewekte spanning. Temperatuurstijging tot 30 ° C gerapporteerd hittestress respons veroorzaken onder deze omstandigheden de levensvatbaarheid van D. discoideum wordt duidelijk verminderd.
wijzigingen
Het protocol kan worden aangepast aan het gedrag van verschillende eiwitten te vergelijken onder dezelfde stressomstandigheden. Hiervoor worden cellen die verschillende eiwitten met dezelfde fluorescerende tag overgebracht in meerdere putjes, zoals vier kamer schotels (sectie 1.3.1). Het protocol kan ook worden toegepast op cellen co-expressie eiwitten met verschillende merkers, zoals GFP of RFP. Dit kan bijvoorbeeld gebruikt om het gedrag van de verschillende componenten van het proteïne kwaliteitscontrole (PQC) wordt gecontroleerd. Cellen die GFP-gemerkte aggregatie marker en anders-RFP tag PCQ componenten kunnen worden waargenomen met behulp van multi-wellvoorgeschoteld voor beeldvorming. Dit zorgt voor dezelfde stress-condities (snelheid van de temperatuur verhogen / verlagen, de duur van de temperatuur stijging / daling) en zorgt voor een vergelijkende studies.
Bovendien kan het protocol worden gebruikt om de invloed van de PQC systeem de hittestress respons studie. De activiteit van de componenten kan worden gemoduleerd door het veranderen van expressieniveaus met behulp van genetische hulpmiddelen zoals het uitschakelen of overexpressie of door toepassing van commercieel beschikbare specifieke inhibitoren 6. Het proteasoom kan worden geremd door toevoeging van MG132 (100 uM) of lactacystine (10 uM) aan het groeimedium. De chaperone Hsp90 kan worden geremd via geldanamycine (6 uM) of radicicol (10 uM). De chaperone Hsp70 kan worden geremd VER-155.088, maar konden niet de effectiviteit van de remming in experimentele instellingen dusver bevestigen. Remmers moet een dag voor beeldvorming worden toegevoegd en de cellen worden gedurende 14 uur.
Criti cal Stappen binnen het Protocol
De kritische stap voor de beoordeling van warmte-geïnduceerde verstoring is de toestand van de cellen voorafgaand aan de beeldvorming experiment. Studies in gist bleek dat cellen verwerven resistentie tegen verschillende omgevingsstressen gedurende stationaire fase 13. We zagen ook een minimale respons op toegepast hittestress indien D. discoideum cellen had stationaire fase bereikt voorafgaand aan beeldvorming. Dus een constante celaantal <5 x 10 5 cellen / ml is cruciaal.
Bovendien kunnen hoge celaantallen overgang induceren van de vegetatieve cyclus van D. discoideum de ontwikkelingscyclus, waardoor triggering honger paden, wat kan leiden tot een andere reactie op stress te verwarmen. Indien hoge cel aantallen worden bereikt in de herstelfase na hittestress, streaming en aggregeren cellen kunnen interfereren met data-analyse als de cellen uit te gaan van de focus (zie figuur 4).
content "> Beperking van de Techniek Betekenis van de techniek met betrekking tot bestaande methoden
In vergelijking met bestaande instellingen zoals het gebruik van kamers met airconditioning, temperatuur-gecontroleerde incubatie dozen met betrekking tot de doelstellingen en de microscoop podium of temperatuurgestuurde podia en objectieve kragen, het gebruik van een koelkamer zorgt voor een meer nauwkeurige controle van de omgevingslucht temperatuur. Het Peltier-element in de koelkamer kan een constante en gelijkmatige tem handhavenperatuur gedurende de experimentele opstelling. In de klassieke opstellingen, kan de lokale temperatuur verschillen leiden tot verschillende uitkomsten observatie. Bovendien kan het snel en snel op geïnduceerde veranderingen in de temperatuur, wanneer klassieke opstellingen langzaam passen geïnduceerde temperatuurveranderingen, met name de temperatuur te verlagen. Het Peltier-element in de koelkamer kan ook betrekking hebben op een groter temperatuurbereik (15-40 ° C) dan klassieke opstellingen, waarmee bereikt temperaturen zoals 15 ° C of 40 ° C is erg moeilijk.
Dictyostelium discoideum is bijzonder gevoelig voor foto-toxiciteit. Eerdere studies gebruikt ascorbaat als straatveger van de foto-toxiciteit te verminderen. Echter, lang imaging periodes vereisen extra suppletie. Bovendien is het gebruik van ascorbaat beperkt tot studies waarbij het mechanisme van belang niet wordt beïnvloed door de antioxidantsupplement. Wij stellen temperatuurgeregelde beeldvorming kan worden gebruikt als alternatief ca.oach foto-toxiciteit te minimaliseren en kan worden gecombineerd met toevoeging van ascorbaat toxiciteit verder afnemen.
Fototoxische effecten kunnen worden geminimaliseerd door een constante en gelijkmatige temperatuur van 23 ° C met een koelkamer. Cellen afgebeeld met behulp temperatuurregeling vertonen minder tekenen van foto-toxiciteit, zoals celronding gedurende een langere tijdsperiode. Dit maakt het ook mogelijk beeldvorming met hogere intensiteiten, kleinere tijdsintervallen of meerdere gezichtsvelden (EPB).
General Application
Hittestress bij hogere temperaturen is aangetoond dat een andere warmte stressrespons 14 veroorzaken. Daarom verhogen van de temperatuur tot 34 ° C of 37 ° C kan een ander induceren. Naast de aangebrachte thermische belasting, kan de duur van een bepaalde stress-situatie worden aangepast aan de onmiddellijke respons of langdurige aanpassing aan hittestress bestuderen.
In het algemeen kunnen de beschreven protocol wordenuitgebreid tot een brede reeks van toepassingen. Omdat de nauwkeurige temperatuurregeling reduceert fototoxische effecten, kan het protocol worden gebruikt in instellingen die een hoge belichtingstijden en / of hogere excitatie lichtintensiteit, bijvoorbeeld voor het visualiseren van eiwitten met een lage expressieniveau vereisen, of bij korte tijdsintervallen tussen imaging, bijvoorbeeld tijdens de time-lapse imaging. Het kan ook voordelig zijn voor het afbeelden van objecten verspreid over de gehele cel, bijvoorbeeld microtubules, omdat deze instellingen vereisen een hoog aantal optische z-profielen.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |