The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Discoideum Dictyostelium הם אמבות בודדות חיים בקרקע הניזונים חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים, אשר נתפסים על ידי phagocytosis. יש לה מחזור חיים ייחודי מדהים כי כבר שטח גדול של מחקר מאז גילויו 1. הריבית בשלב המוקדמת של התפתחות רבה-תאית 2 ואת הבסיס המולקולרי של chemotaxis 3 הושלמה בקרוב על ידי מחקרי התמקדות תנועתיות תא, קוטביות בתא, חסינות מולדת. בנוסף, ד discoideum הוצג כמערכת מודל 4,5 המחקר הביו-רפואי.
לאחרונה, הקמנו ד discoideum כמערכת חדשה ללמוד את בקרת איכות חלבון (PQC) 6,7 המערכת. Proteome שלה הוא מועשר בחלבוני צבירה נוטה כמו-פריון, אשר מציב אתגר בפני בקרת איכות חלבון 8. כדי לחקור האם ד discoideum פתחה מנגנונים מולקולריים מיוחדים לשלוט AG ביותר שלהgregation נוטה proteome חקרנו את ההתנהגות של חלבוני סמן נוטה צבירה הוא בתנאי צמיחה נורמלים במהלך מתח. בתנאי עקה, כגון עומס החום, שניתן להשתמש בהם כדי להגביר את קצב חלבון misfolding 9. לכן, חיפשנו מערכת שבה נוכל לגרום שינויי טמפרטורה ובמקביל לעקוב אחר ההתנהגות של חלבונים סמן. לשם כך, אנו בשילוב הדמית תא חי עם חימום מבוקר פלטייה באמצעות כנס במה תרמי (תא קירור). שיטה זו אפשרה לנו לשמור על טמפרטורה קבועה ואחידה וכן לגרום לשינוי טמפרטורה מהיר, עדיין מדויק.
הדמית תא חי משמשת ללמוד מגוון של תהליכים ביולוגיים ד discoideum. עם זאת, גישה זו עומדת בפני שתי מגבלות עיקריות. ראשית, התאים להציג תנועתיות גבוהה נוטים להגר אל מחוץ לשדה הראייה, ובכך המעקב של תאים בודדים לעתים קרובות דורש הדמיה של שטח גדול. ניידות התא יכוללהיות מופחת על ידי כיסוי 10 אגרו, עם זאת, תנאים אלה אינם מתאימים הדמיה לטווח ארוכה בשל ירידה כדאיות. שנית, ד תאי discoideum להראות רגישות גבוהה במיוחד רעילות צילום, שתוצאתה עיגול תא מעצר mitotic 11. פרוטוקולים קודמים לטפל בבעיה זו על ידי תוספת של ascorbate כמחסל רדיקלי וצמצום חשיפה פעמים 12. האחרון יכול להיות קריטי אם החלבון של העניין מתבטא ברמות נמוכות ומראה אות קרינה חלשה. המחברים גם מציעים לספק טמפרטורה קבועה של 21 מעלות צלזיוס או על ידי הדמיה בחדר ממוזג או באמצעות תיבות דגירת בקרת טמפרטורה, אשר מכסות את הבמה האובייקטיבית מיקרוסקופ 12.
כאן, אנו מתארים שיטה עם בקרת טמפרטורה משופרת באמצעות תא קירור נקבע על 23 מעלות צלזיוס. במהלך הדמית ההגדרה שלנו משפר באופן משמעותי את ההתנגדות רעילה צילום. זהמאפשר את השימוש של פעמי חשיפה גבוהות ועוצמות אור עירור גבוהות. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת במהלך ההדמיה זמן לשגות, כפי מרווחי הזמן צריך להיות מאוזן בקפידה מול מספר המשרות צילמו את זמן החשיפה לשמש. האפשרות להגדיל את מספר משרות צלמו גם מאפשרת כיסוי של אזור הדמיה רחב יותר ומקל מעקב של תאים בודדים על פני תקופה ארוכה של זמן.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות של חלבון מסוים של ריבית בתגובה ללחץ חום נגרם. העלאת הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס דווחה כדי לעורר תגובה חום מתח בתנאים אלה את הכדאיות של ד discoideum מצטמצם במידה ניכרת.
שינויים
הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים שונים באותם תנאי המתח. לשם כך, תאי מבטאי חלבונים שונים עם התג פלורסנט באותו מועברים לתוך מנות רבות גם, כגון ארבע מנות קאמריות (סעיף 1.3.1). הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על תאי שיתוף לבטא חלבונים עם סמנים שונים, כגון GFP או RFP. זה יכול להיות למשל להשתמש כדי לפקח על התנהגותם של מרכיבים שונים של בקרת איכות חלבון (PQC) המערכת. תאים להביע את סמן צבירה מתויג GFP ורכיבי PCQ RFP-tagged שונים ניתן לצפות באמצעות היטב רביםהשביע הדמיה. הדבר מבטיח אותם תנאי המתח (מהירות העלאת טמפרטורה / ירידה, משכו זמן ירידת טמפרטורת גידול /) ומאפשר מחקרים השוואתיים.
יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מערכת PQC על תגובת עומס חום. הפעילות של הרכיבים יכולה להיות מווסתת על ידי שינוי רמות ביטוי באמצעות כלים גנטיים כגון נוק-אאוט או ביטוי יתר או באמצעות מעכבים ספציפיים זמינים מסחרי 6. הפרוטאזום יכול להיות מעוכב על ידי הוספת MG132 (100 מיקרומטר) או lactacystin (10 מיקרומטר) אל מדיום הגידול. המלווה Hsp90 יכול להיות מעוכבים באמצעות geldanamycin (6 מיקרומטר) או radicicol (10 מיקרומטר). המלווה Hsp70 יכול להיות מעוכב עם VER-155,088, למרות שאנחנו לא יכולים לאשר את היעילות של העיכוב במסגרות הניסיוניות שלנו עד כה. מעכבים יש להוסיף יום אחד לפני הדמית התאים וטופחו במשך 14 שעות.
Criti צעדי cal בתוך הפרוטוקול
השלב הקריטי להערכת הפרעות החומות נגרם הוא המדינה של התאים לפני ניסוי ההדמיה. מחקרים הראו כי תאי שמרים לרכוש עמידות מגוון של לחצים סביבתיים בשלב נייח 13. אנו הבחנו גם היענות מינימלית עומס החום מיושם אם ד תאי discoideum הגיעו שלב נייח לפני ההדמיה. לכן, שמירה על מספר תא קבוע <5 x 10 5 תאים / מיליליטר הוא קריטי.
יתר על כן, מספרים סלולריים גבוהים יכולים לגרום מעבר מהמעגל וגטטיבי של ד Discoideum למעגל התפתחותית, ובכך מפעיל מסלולים רעבים, אשר עלול להוביל לתגובה שונה לחום מתח. אם מספרים סלולריים גבוהים מתקבלים שלב ההחלמה לאחר עומס חום, הזרמה ותאי צבירה יכולים להפריע ניתוח נתונים שעליהם בנויי התאים לנוע מחוץ לפוקוס (ראה איור 4).
תוכן "> הגבלת הטכניקה משמעות של הטכניקה ביחס שיטות קיימות
לשם השוואה עם setups קיים כגון השימוש של חדרים ממוזגים, תיבות דגירת בקרת טמפרטורה מכסות את היעדים ואת הבמה מיקרוסקופ או בשלבי בקרת טמפרטורה וצווארוני מטרה, השימוש בתא קירור מספק שליטה מדויקת יותר של הסביבה טֶמפֶּרָטוּרָה. פלטייה האלמנט בתא הקירור יכול לשמור על TEM קבוע והאחידperature ברחבי ההתקנה הניסיונית. ב setups הקלסית, הבדלי טמפרטורה מקומיים עשויים להוביל לתוצאות תצפית שונות. יתר על כן, הוא יכול להגיב במהירות במהירות לשינויים מושרים הטמפרטורה, בעוד setups הקלסית להסתגל לאט מאוד לשינויי טמפרטורה מושרות, במיוחד הורדת הטמפרטורה. פלטייה אלמנט בתא הקירור יכול גם לכסות טווח טמפרטורה רחב יותר (15-40 מעלות צלזיוס) מ setups הקלאסית, שבה הטמפרטורות להגיע כמו 15 מעלות צלזיוס או 40 ° C הוא מאוד קשה.
Discoideum Dictyostelium הוא רגיש במיוחד רעילות צילום. מחקרים קודמים השתמשו ascorbate כמו נבלות להפחית רעילות צילום. עם זאת, תקופות הדמיה ארוכות דורשות תוספת נוספת. יתר על כן, השימוש ascorbate מוגבל ללימודים בהן מנגנון הריבית אינו מושפע תוסף נוגד חמצון. אנו מציעים כי הדמיה שבשליטת הטמפרטורה יכולה לשמש חלופה apprאוח למזער רעילות תמונה וניתן לשלבו עם תוספת של ascorbate להפחית רעילות נוספת.
תופעות phototoxic ניתן למזער על ידי מתן טמפרטורה קבועה ואחידה של 23 ° C באמצעות תא קירור. תאים הדמיה באמצעות בקרת טמפרטורה להראות פחות סימנים של רעילות צילום, עיגול תא כזה, במשך פרק זמן ארוך יותר. זה גם מאפשר הדמיה עם עוצמות גבוהות, מרווחי זמן קטנים יותר או יותר שדות נוף (FOVs).
יישום כללי
עומס חום בטמפרטורות גבוהות הוכח לעורר תגובת לחץ חום שונה 14. לכן, הגדלת הטמפרטורה ל 34 מעלות צלזיוס או 37 ° C עלולה לגרום תגובה שונה. בנוסף לחץ הטמפרטורה מיושם, משך מצב מתח מסוים יכול להיות שונה כדי לחקור את התגובה המיידית או הסתגלות לטווח ארוך לחום מתח.
באופן כללי, הפרוטוקול המתואר יכול להיותהתרחב מערך רחב של יישומים. מאחר בקרת הטמפרטורה המדויקת מפחיתה באופן משמעותי אפקטים לתמונה רעילה, הפרוטוקול ניתן להשתמש במסגרות הדורשות זמני חשיפה גבוהים ו / או עוצמות אור עירור גבוהות, למשל, המאפשרים הדמית חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה, או בשילוב עם מרווחי זמן קצרים בין הדמיה, למשל, במהלך ההדמיה זמן לשגות. זה גם יכול להיות יתרון עבור הדמיה חפצה פורש התא כולו, למשל, microtubules, כמו הגדרות אלה דורשים מספר גבוה של z-חלקים אופטיים.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |