The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum er enslig jord levende amøber som lever av bakterier og andre mikroorganismer, som er tatt opp av fagocytose. Den har en unik og bemerkelsesverdig livssyklus som har vært et viktig område for forskning siden den ble oppdaget en. Den tidlige interesse for flercellet utvikling 2 og molekylære grunnlaget for chemotaxis tre ble snart supplert med studier som fokuserer på cellemotilitet, celle polaritet, medfødt immunitet. I tillegg D. discoideum ble innført som et modellsystem for biomedisinsk forskning 4,5.
Nylig etablerte vi D. discoideum som et nytt system for å studere proteinet kvalitetskontroll (PQC) systemet 6,7. Dens proteom er beriket i aggregering utsatte prion-lignende proteiner, som er en utfordring for protein kvalitetskontroll 8. For å undersøke om D. discoideum har utviklet spesielle molekylære mekanismer for å kontrollere den svært agforsamlingen utsatt proteom- studerte vi oppførselen til aggregering utsatt for markørproteiner både under normale vekstbetingelser og under stress. Spenningstilstander, for eksempel varmebelastning, kan brukes til å øke frekvensen av proteinet misfolding 9. Derfor søkte vi et system hvor vi kan indusere temperaturendringer og samtidig følge oppførselen til markørproteiner. For dette formålet, kombinert vi levende celle bildebehandling med Peltier-kontrollert oppvarming ved hjelp av en varmetrinn innsats (kjølekammer). Denne metoden tillot oss å opprettholde en konstant og jevn temperatur, så vel som å indusere en hurtig, men likevel nøyaktig temperaturendringer.
Levende celle avbildning blir brukt til å studere en rekke biologiske prosesser i D. discoideum. Men denne tilnærmingen står overfor to hovedbegrensninger. Først cellene viser en høy motilitet og har en tendens til å migrere ut av betraktningsfeltet, således sporing av individuelle celler krever ofte avbildning av et stort område. Cellen mobilitet kanreduseres med Agar overlegg 10, men disse forholdene er ikke egnet for langsiktig bildebehandling på grunn av en nedgang i levedyktighet. Sekund, D. discoideum celler viser en særlig høy følsomhet for fototoksisitet, noe som resulterer i celleavrunding og mitotisk stopp 11. Tidligere protokoller løst problemet ved tilsetting av askorbat som en radikaler og reduksjon av eksponering ganger 12. Sistnevnte kan være kritisk dersom proteinet av interesse er uttrykt på lave nivåer og viser en svak fluorescens signal. Forfatterne foreslår også å gi en konstant temperatur på 21 ° C, enten ved bildebehandling i en luftkondisjonerte rom eller ved hjelp av temperaturkontrollerte ruge bokser, som dekker mål og mikroskop scenen 12.
Her beskriver vi en fremgangsmåte med forbedret temperaturkontroll ved hjelp av et kjølekammer innstilt ved 23 ° C. Under bildebehandling vår set-up øker betydelig motstand mot foto-toksisitet. Dentillater bruk av høyere eksponeringstider og høyere eksitasjon lysintensitet. Dette er av særlig viktighet i løpet av time-lapse avbildning, som de tidsintervaller som må være nøye balansert mot antall posisjoner avbildes og eksponeringstiden som brukes. Muligheten for å øke antall avbildes stillinger gjør det også mulig dekning av en større bildeområdet og muliggjør sporing av individuelle celler i løpet av en lengre tidsperiode.
Protokollen er beskrevet her kan brukes til å studere oppførselen til et bestemt protein av interesse som respons på varmeinduserte stress. Temperaturøkning til 30 ° C er rapportert å utløse varmestressrespons og under disse betingelser levedyktighet av D. discoideum reduseres markert.
modifikasjoner
Protokollen kan modifiseres for å sammenligne adferden til andre proteiner under de samme stressbetingelser. For dette er celler som uttrykker ulike proteiner med samme fluoriserende tag overført til multi-brønn retter, for eksempel fire kammer retter (seksjon 1.3.1). Protokollen kan også anvendes på celler ko-uttrykker proteiner med forskjellige markører, slik som GFP eller RFP. Dette kan for eksempel brukes til å overvåke oppførselen til forskjellige komponenter i protein kvalitetskontroll (PQC) system. Celler som uttrykker GFP-merket aggregering markør og ulike RFP-merket PCQ komponenter kan observeres ved hjelp av multi-brønndisket for bildebehandling. Dette gir de samme spenningsforholdene (hastighet for temperaturøkning / reduksjon, varighet av temperaturøkningen / reduksjon) og gjør det mulig for komparative studier.
Videre kan protokollen brukes til å studere innvirkningen av PQC systemet på varmestressrespons. Aktiviteten av komponentene kan moduleres ved å forandre ekspresjonsnivåer ved hjelp av genetiske verktøy som knock-out eller overekspresjon eller ved å bruke kommersielt tilgjengelige spesifikke inhibitorer 6. Proteasomet kan bli inhibert ved tilsetning av MG132 (100 uM) eller laktacystin (10 pM) til vekstmediet. Den anstand HSP90 kan hemmes ved bruk geldanamycin (6 mm) eller radicicol (10 mm). Den anstand Hsp70 kan hemmes med VER-155 088, selv om vi ikke kunne bekrefte effekten av hemming i våre eksperimentelle innstillinger så langt. Inhibitorer bør legges en dag før avbilding og cellene blir inkubert i 14 timer.
Criti cal trinn i protokollen
Den kritiske trinn for vurdering av varme-indusert forstyrrelse er staten av cellene før bildebehandling eksperimentet. Studier i gjær viste at celler som utvikler resistens mot en rekke miljømessige påkjenninger under stasjonær fase 13. Vi har også observert minimal respons til anvendt varme stress hvis D. discoideum celler hadde nådd stasjonær fase før bildebehandling. Derfor er å opprettholde en konstant celletall <5 x 10 5 celler / ml kritisk.
Videre kan høy celleantall indusere overgang fra den vegetative syklus av D. discoideum til utviklingssyklus, og dermed utløser sult veier, som kan føre til en forskjellig respons på varmestress. Dersom høyt celleantall er nådd i restitusjonsfasen etter varmestress, streaming og samles cellene kan forstyrre dataanalyse som cellene beveger seg ut av fokus (se figur 4).
innhold "> Begrensning av Technique Betydningen av teknikken i forhold til eksisterende metoder
Sammenlignet med eksisterende oppsett som bruk av rom med klimaanlegg, temperaturkontrollert ruge bokser som dekker målene og mikroskop scene eller temperaturkontrollerte etapper og objektive krager, bruk av et kjølekammer gir en mer presis styring av omgivelses temperatur. Peltier-elementet i kjølekammeret kan opprettholde en konstant og jevn temratur gjennom hele forsøksoppsettet. I klassisk oppsett, kan lokale temperaturforskjeller fører til forskjellige observasjons utfall. Videre kan det reagere raskt og hurtig til induserte endringer i temperatur, mens klassiske oppsett tilpasse seg meget langsomt for å induserte temperaturendringer, særlig senke temperaturen. Peltier-elementet i kjølekammeret kan også dekke et bredere temperaturområde (15-40 ° C) enn klassiske oppsett, som strekker temperaturer slik som 15 ° C eller 40 ° C er meget vanskelig.
Dictyostelium discoideum er spesielt følsomme for foto-toksisitet. Tidligere studier brukes askorbat som gatefeier å redusere foto-toksisitet. Men lange bilde perioder trenger ekstra tilskudd. Dessuten er bruken av askorbat begrenset til undersøkelser hvor mekanismen av interesse ikke påvirkes av antioksidant supplement. Vi foreslår at temperaturkontrollert avbildning kan brukes som et alternativ ca.oach å minimalisere fototoksisitet og kan være kombinert med tilsetning av askorbat for ytterligere å redusere toksisitet.
Fototoksiske effekter kan minimaliseres ved å tilveiebringe en konstant og ensartet temperatur på 23 ° C ved hjelp av et kjølekammer. Celler avbildes med temperaturkontroll viser færre tegn på foto-toksisitet, slik celle avrunding, for en lengre tidsperiode. Dette gjør også bildebehandling med høyere intensitet, mindre tidsintervaller eller flere synsfelt (FOVs).
allmenngjørings
Varmebelastning ved høyere temperaturer har vist seg å utløse en annen varmestressrespons 14. Derfor øker temperaturen til 34 ° C eller 37 ° C kan forårsake en forskjellig respons. I tillegg til den anvendte temperatur stress, kan varigheten av en bestemt spenning situasjon modifiseres for å studere den umiddelbare responsen eller langvarig tilpasning til varmestress.
Generelt kan den beskrevne protokollen bliutvidet til et bredt sett av anvendelser. Fordi den nøyaktige temperaturkontrollen i betydelig grad reduserer foto-toksiske effekter, kan protokollen som brukes i miljøer som krever høye eksponeringstider og / eller høyere eksiteringsfrekvenser lysintensiteter, for eksempel for visualisering av proteinene med et lavt ekspresjonsnivå, eller i kombinasjon med korte tidsintervaller mellom bildebehandling, for eksempel i løpet av time-lapse imaging. Det kan også være fordelaktig for å avbilde objekter som strekker seg over hele cellen, for eksempel, mikrotubuli, da disse innstillinger krever et høyt antall optiske z-seksjoner.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |