The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum são solitários amebas de vida do solo que se alimentam de bactérias e outros microorganismos, que são ocupados por fagocitose. Ele tem um ciclo de vida único e notável que tem sido uma importante área de pesquisa desde a sua descoberta 1. O interesse no início do desenvolvimento multicelular 2 e as bases moleculares da quimiotaxia 3 logo foi complementada por estudos sobre motilidade celular, polaridade celular, imunidade inata. Além disso, D. discoideum foi introduzido como um sistema modelo para 4,5 pesquisa biomédica.
Recentemente, estabelecemos D. discoideum como um novo sistema para estudar a 6,7 sistema de controle de qualidade da proteína (PQC). Sua proteoma é enriquecida com proteínas prião-como agregação-prone, o que representa um desafio a proteína de controlo de qualidade 8. Para investigar se a D. discoideum desenvolveu mecanismos moleculares especiais para controlar a sua altamente agproteoma congregação propensas, estudamos o comportamento de proteínas marcadoras de agregação propensas tanto em condições normais de crescimento e durante o estresse. Condições de estresse, tais como estresse por calor, pode ser usado para aumentar a taxa de proteína misfolding 9. Portanto, buscamos um sistema em que poderia induzir mudanças de temperatura e ao mesmo tempo seguir o comportamento de proteínas marcadoras. Para este efeito, combinamos de imagem de células vivas com aquecimento controlado por Peltier usando um (câmara de refrigeração) inserção fase térmica. Este método permitiu-nos manter a temperatura constante e uniforme, bem como para induzir uma mudança rápida, ainda preciso da temperatura.
Processamento de imagem de células vivas, são utilizados para estudar uma variedade de processos biológicos em D. discoideum. No entanto, esta abordagem enfrenta dois grandes limitações. Em primeiro lugar, as células apresentam uma alta mobilidade e tendem a migrar para fora do campo de visão, rastreando assim de células individuais muitas vezes requer imagiologia de uma grande área. A mobilidade celular podeser reduzida em Agar sobreposição 10, no entanto, estas condições não são adequadas para a imagem latente a longo prazo devido a um declínio na viabilidade. Em segundo lugar, D. células discoideum mostram uma sensibilidade particularmente elevada para foto-toxicidade, o que resulta no arredondamento celular e 11 de paragem da mitose. Protocolos anteriores abordou esta questão através da adição de ácido ascórbico como um limpador radical e redução da exposição vezes 12. Esta última pode ser importante se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos e mostra um sinal de fluorescência fraca. Os autores sugerem também para proporcionar uma temperatura constante de 21 ° C, quer por imagem em um quarto com ar condicionado ou utilizando caixas de incubação com temperatura controlada, que cobrem o objetivo e microscópio estágio 12.
Aqui, nós descrevemos um método com um controlo melhorado da temperatura usando uma câmara de arrefecimento ajustado a 23 ° C. Durante a gravação nosso set-up aumenta significativamente a resistência à foto-toxicidade. istopermite a utilização de tempos de exposição mais elevadas e intensidades de luz de excitação mais elevados. Isto é de particular importância durante a imagem de lapso de tempo, como os intervalos de tempo precisa de ser cuidadosamente equilibrado contra o número de posições representada por imagem e o tempo de exposição utilizado. A possibilidade de aumentar o número de posições fotografada também permite que a cobertura de uma área de imagem mais largo e facilita a identificação de células individuais ao longo de um período mais longo de tempo.
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para estudar o comportamento de uma proteína de interesse particular, em resposta ao stress induzido por calor. O aumento de temperatura para 30 ° C tem sido relatado para desencadear resposta de stress de calor e sob estas condições, a viabilidade de D. discoideum é marcadamente reduzida.
modificações
O protocolo pode ser modificado para comparar o comportamento de proteínas diferentes sob as mesmas condições de stress. Para isso, as células que expressam diferentes proteínas com a mesma etiqueta fluorescente são transferidos para placas de multi-poços, tal como quatro pratos de câmara (secção 1.3.1). O protocolo também pode ser aplicada em células de proteínas com diferentes marcadores, tais como GFP ou RFP que co-expressam. Isto pode ser por exemplo utilizado para monitorar o comportamento de diferentes componentes do sistema de controlo de qualidade de proteínas (PQC). As células que expressam marcador agregação GFP-marcadas e diferentes componentes PCQ marcado-RFP pode ser observado usando multi-bemcôncavo para a imagem latente. Isso garante as mesmas condições de estresse (velocidade de aumento da temperatura / diminuição, a duração da temperatura aumento / diminuição) e permite a realização de estudos comparativos.
Além disso, o protocolo pode ser utilizado para estudar a influência do sistema de PQC na resposta ao stress de calor. A actividade dos componentes pode ser modulada pela alteração dos níveis de expressão utilizando ferramentas genéticas, tais como knock-out ou a sobre-expressão ou utilizando inibidores específicos disponíveis comercialmente 6. O proteassoma pode ser inibida pela adição de MG132 (100 uM) ou lactacistina (10 uM) ao meio de crescimento. O acompanhante Hsp90 pode ser inibida utilizando geldanamicina (6 uM), ou do radicicol (10 uM). O acompanhante Hsp70 pode ser inibida com VER-155088, embora não pudemos confirmar a eficácia da inibição em nossas configurações experimentais até agora. Inibidores deve ser adicionado um dia antes de imagem e as células são incubadas durante 14 horas.
Criti Passos cal no âmbito do Protocolo
O passo crítico para a avaliação da perturbação induzida pelo calor é o estado das células antes da experiência de imagem. Estudos em leveduras demonstraram que as células adquirem resistência a uma variedade de stresses ambientais durante a fase estacionária 13. Observou-se também a capacidade de resposta mínima ao estresse térmico aplicado, se D. células discoideum tinha atingido fase estacionária antes da imagem. Por conseguinte, a manutenção de um número constante de célula <5 x 10 5 células / ml é crítica.
Além disso, o número de células elevadas pode induzir a transição do ciclo vegetativo de D. discoideum com o ciclo de desenvolvimento, desencadeando assim as vias de fome, o que pode levar a uma resposta diferente ao estresse térmico. Se o número de células altas são alcançadas na fase de recuperação após o estresse de calor, streaming e células agregando pode interferir com a análise de dados como as células se movem fora de foco (veja a Figura 4).
content "> limitação da técnica Importância da Técnica em Matéria de métodos existentes
Em comparação com configurações existentes, tais como o uso de quartos com ar condicionado, caixas de incubação de temperatura controlada, relativos aos objectivos e as etapas de palco microscópio ou com temperatura controlada e colares objetivos, o uso de uma câmara de resfriamento proporciona um controle mais preciso do ambiente temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode manter uma TEM constante e uniformeratura em toda a configuração experimental. Em configurações clássicas, diferenças de temperatura locais pode levar a resultados diferentes de observação. Além disso, ele pode responder rapidamente e rapidamente a mudanças induzidas na temperatura, enquanto instalações clássicas adaptar-se muito lentamente a mudanças de temperatura induzidas, especialmente a diminuição da temperatura. O elemento de Peltier na câmara de refrigeração pode também cobrir uma gama mais ampla de temperatura (15-40 ° C) do que instalações clássicas, com as quais as temperaturas que alcançam, tais como 15 ° C ou 40 ° C é muito difícil.
Dictyostelium discoideum é particularmente sensível a foto-toxicidade. Estudos anteriores utilizaram ascorbato como limpador para reduzir foto-toxicidade. No entanto, períodos de imagem longos exigem suplementação adicional. Além disso, o uso de ácido ascórbico está limitado a estudos em que o mecanismo de interesse não é afectado por o suplemento de antioxidante. Propomos que a imagem de temperatura controlada pode ser utilizada como uma alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidade e pode ser combinado com a adição de ácido ascórbico para diminuir ainda mais a toxicidade.
efeitos fototóxicos pode ser minimizado através de uma temperatura constante e uniforme de 23 ° C utilizando uma câmara de arrefecimento. Células fotografada usando controle de temperatura mostram menos sinais de foto-toxicidade, esse arredondamento celular, por um período de tempo mais longo. Isso também permite imagens com maior intensidade, intervalos de tempo menores ou mais campos de visão (FOVs).
Aplicação geral
O stress térmico a temperaturas mais elevadas tem sido mostrado para desencadear uma resposta de stress de calor diferente 14. Portanto, aumentando a temperatura para 34 ° C ou 37 ° C podem induzir uma resposta diferente. Em adição ao stress de temperatura é aplicado, a duração de uma situação de stress particular pode ser modificado para estudar a resposta imediata ou adaptação a longo prazo a stress térmico.
Em geral, o protocolo pode ser descritoexpandiu-se para um amplo conjunto de aplicações. Uma vez que o controle preciso da temperatura reduz consideravelmente os efeitos foto-tóxicas, o protocolo pode ser utilizado em ambientes que exigem tempos de exposição elevada e / ou intensidades de luz de excitação mais elevadas, por exemplo, para visualizar as proteínas com um nível de expressão baixo, ou em combinação com intervalos de tempo curtos entre imagem, por exemplo, durante a imagem time-lapse. Também pode ser vantajoso para imagiologia de objectos que abrangem toda a célula, por exemplo, os microtúbulos, uma vez que estas configurações necessitam de um elevado número de z-secções ópticas.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |