The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.
The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system.
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.
Dictyostelium discoideum amebas son solitarios la vida del suelo que se alimentan de bacterias y otros microorganismos, que son absorbidos por fagocitosis. Tiene un ciclo de vida única y singular que ha sido un área importante de la investigación desde su descubrimiento 1. El interés en el desarrollo temprano multicelular 2 y la base molecular de la quimiotaxis 3 pronto se complementa con estudios centrados en la motilidad celular, la polaridad celular, la inmunidad innata. Además, D. discoideum se introdujo como un sistema modelo para la investigación biomédica 4,5.
Recientemente, hemos establecido D. discoideum como un nuevo sistema para estudiar el sistema de control de 6,7 calidad de la proteína (PQC). Su proteoma está enriquecida en proteínas priónicas-como agregación propensos, lo que plantea un reto al control de calidad de las proteínas 8. Para investigar si D. discoideum ha desarrollado mecanismos moleculares especiales para controlar su muy agproteoma congregación propensas, se estudió el comportamiento de las proteínas marcadoras agregación propensos tanto en condiciones de crecimiento normales y durante el estrés. Condiciones de estrés, tales como el estrés por calor, se pueden utilizar para aumentar la tasa de proteínas misfolding 9. Por lo tanto, se buscó un sistema en el que podríamos inducir cambios de temperatura y al mismo tiempo seguir el comportamiento de las proteínas marcadoras. Para este propósito, se combinaron imágenes de células vivas con calefacción controlada por sistema Peltier utilizando una (cámara de enfriamiento) inserto etapa térmica. Este método nos permitió mantener una temperatura constante y uniforme, así como para inducir un cambio rápido, pero precisa de la temperatura.
Imágenes de células vivas se utiliza para estudiar una variedad de procesos biológicos en D. discoideum. Sin embargo, este enfoque se enfrenta a dos limitaciones importantes. En primer lugar, las células muestran un alto motilidad y tienden a migrar fuera del campo de visión, el seguimiento tanto de las células individuales a menudo requiere de formación de imágenes de un área grande. La movilidad celular puedereducirse en agar de recubrimiento 10, sin embargo, estas condiciones no son adecuadas para formación de imágenes a largo plazo debido a una disminución de la viabilidad. En segundo lugar, D. discoideum células muestran una particularmente alta sensibilidad a la foto-toxicidad, lo que resulta en el redondeo celular y detención mitótica 11. Protocolos anteriores abordan este problema mediante la adición de ascorbato como un eliminador de radicales y reducción de los tiempos de exposición 12. Este último puede ser crítica si la proteína de interés se expresa en niveles bajos y muestra una señal de fluorescencia débil. Los autores también sugieren para proporcionar una temperatura constante de 21 ° C, ya sea por formación de imágenes en una habitación con aire acondicionado o mediante el uso de cajas de incubación a temperatura controlada, que cubren la etapa objetiva y microscopio 12.
A continuación, describimos un método con control de temperatura mejorado mediante el uso de una cámara de enfriamiento ajustado a 23 ° C. Durante una imagen nuestra puesta a punto mejora significativamente la resistencia a la fototoxicidad. Esopermite el uso de los tiempos de exposición superiores e intensidades de luz de excitación más altos. Esto es de particular importancia cuando se toman imágenes de lapso de tiempo, ya que los intervalos de tiempo tienen que ser sopesado frente a la cantidad de puestos fotografiados y el tiempo de exposición utilizado. La posibilidad de aumentar el número de posiciones fotografiadas también permite la cobertura de un área de imagen más ancho y facilita el seguimiento de las células individuales en un periodo de tiempo más largo.
El protocolo descrito aquí se puede utilizar para estudiar el comportamiento de una proteína particular de interés en respuesta al estrés inducida por calor. Aumento de la temperatura a 30 ° C ha sido reportado para desencadenar la respuesta de estrés de calor y bajo estas condiciones, la viabilidad de D. discoideum se reduce notablemente.
modificaciones
El protocolo puede ser modificado para comparar el comportamiento de diferentes proteínas en las mismas condiciones de estrés. Para esto, las células que expresan diferentes proteínas con la misma etiqueta fluorescente se transfieren en placas de múltiples pocillos, tal como cuatro platos de cámara (sección 1.3.1). El protocolo también se puede aplicar sobre las células proteínas con diferentes marcadores, tales como GFP o RFP co-expresan. Esto puede ser por ejemplo utilizado para monitorear el comportamiento de los diferentes componentes del sistema de control de calidad de la proteína (PQC). Las células que expresan el marcador agregación BPA de etiquetado y diferentes componentes PCQ RFP-etiquetados se pueden observar utilizando múltiples pocillosen forma de plato para la imagen. Esto asegura las mismas condiciones de estrés (velocidad de aumento de la temperatura / disminución, la duración de la temperatura de aumento / disminución) y permite estudios comparativos.
Además, el protocolo se puede utilizar para estudiar la influencia del sistema de PQC en la respuesta al estrés de calor. La actividad de los componentes puede ser modulado por cambios en los niveles de expresión utilizando herramientas genéticas tales como knock-out o sobreexpresión o mediante el uso de inhibidores específicos disponibles en el mercado 6. El proteasoma puede ser inhibida por la adición de MG132 (100 M) o lactacistina (10 M) al medio de crecimiento. La chaperona Hsp90 puede ser inhibida usando geldanamicina (6 M) o radicicol (10 M). La chaperona Hsp70 puede inhibirse con VER-155 088, aunque no pudimos confirmar la eficacia de la inhibición en nuestras condiciones experimentales hasta ahora. Los inhibidores se deben añadir un día antes de formación de imágenes y las células se incuban durante 14 hr.
Criti Cal pasos dentro del Protocolo
El paso crítico para la evaluación de la perturbación inducida por calor es el estado de las células antes del experimento de formación de imágenes. Los estudios en levadura mostraron que las células adquieren resistencia a una variedad de problemas ambientales durante la fase estacionaria 13. También se observó la capacidad de respuesta mínima al estrés térmico aplicado si D. discoideum células habían alcanzado la fase estacionaria antes de la imagen. Por lo tanto, el mantenimiento de un número constante de celda <5 x 10 5 células / ml es crítica.
Por otra parte, el número de células altas pueden inducir la transición del ciclo vegetativo de D. discoideum con el ciclo de desarrollo, lo que desencadena vías de hambre, lo que podría dar lugar a una respuesta diferente al estrés por calor. Si se alcanzan altos números de células en la fase de recuperación después de estrés por calor, streaming y células de agregación pueden interferir con el análisis de datos como las células se mueven fuera de foco (véase la Figura 4).
contenido "> limitación de la técnica Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes
En comparación con las configuraciones existentes, tales como el uso de habitaciones con aire acondicionado, cajas de incubación a temperatura controlada relativas a los objetivos y las etapas platina del microscopio o con control de temperatura y collares objetivos, el uso de una cámara de enfriamiento proporciona un control más preciso del ambiente temperatura. El elemento Peltier en la cámara de refrigeración puede mantener una tem constante y uniformetura a lo largo de la configuración experimental. En configuraciones clásicas, las diferencias de temperatura locales podrían dar lugar a resultados diferentes de observación. Además, se puede responder de forma rápida y rápidamente a los cambios inducidos en la temperatura, mientras que las configuraciones clásicas se adaptan muy lentamente a los cambios inducidos por la temperatura, especialmente la reducción de la temperatura. El elemento Peltier en la cámara de enfriamiento también puede cubrir una gama más amplia de temperatura (15-40 ° C) que las configuraciones clásicas, con el que las temperaturas que alcanzan tales como 15 ° C o 40 ° C es muy difícil.
Dictyostelium discoideum es particularmente sensible a la foto-toxicidad. Estudios previos han usado ascorbato como eliminador para reducir la fototoxicidad. Sin embargo, los períodos de formación de imágenes largas requieren suplementos adicionales. Por otra parte, el uso de ascorbato se limita a estudios en los que el mecanismo de interés no se ve afectada por el suplemento antioxidante. Proponemos que la imagen de temperatura controlada se puede utilizar como una alternativa aproxoach para minimizar foto-toxicidad y se podría combinar con la adición de ascorbato para disminuir aún más la toxicidad.
efectos fototóxicas pueden minimizarse proporcionando una temperatura constante y uniforme de 23 ° C usando una cámara de enfriamiento. Las células imágenes utilizando el control de temperatura muestran menos signos de foto-toxicidad, tal redondeo celular, por un período de tiempo más largo. Esto también permite obtener imágenes con intensidades más altas, intervalos de tiempo más cortos o más campos de visión (FOV).
Aplicacion General
El estrés por calor a temperaturas más altas se ha demostrado para desencadenar una respuesta de estrés diferente de calor 14. Por lo tanto, aumentando la temperatura hasta 34 ° C o 37 ° C podría inducir una respuesta diferente. Además del estrés temperatura aplicada, la duración de una situación de estrés en particular puede ser modificado para estudiar la respuesta inmediata o adaptación a largo plazo al estrés por calor.
En general, el protocolo descrito puede serexpandido a una amplia gama de aplicaciones. Dado que el control preciso de la temperatura reduce considerablemente efectos de foto-tóxico, el protocolo se puede utilizar en entornos que requieren altos tiempos de exposición y / o intensidades de luz de excitación más altos, por ejemplo, para la visualización de las proteínas con un bajo nivel de expresión, o en combinación con intervalos de tiempo cortos entre las imágenes, por ejemplo, cuando se toman imágenes de lapso de tiempo. También puede ser ventajoso para obtener imágenes de objetos que abarcan toda la célula, por ejemplo, los microtúbulos, ya que estos ajustes requieren un alto número de z secciones ópticas.
The authors have nothing to disclose.
The authors have no Acknowledgements.
AX Medium | ForMedium | AXM0102 | |
LoFlo medium | ForMedium | LF1001 | |
MG132 | Sigma | C2211 | |
Lactacystin | Sigma | L6785 | |
Geldanamycin | Santa Cruz | sc-200617 | |
Radicicol | Santa Cruz | sc-200620 | |
MatTek disch 35 mm | MatTek corporation | P35G-1.5-14-C | glass bottom imaging dish |
CellViell cell culture dish | Greiner | 627870 | 4-compartments glass bottom imaging dish |
Thermal Stage Heater/Cooler Insert | Warner Istruments | TB-3/CCD | |
Bipolar temperature controller | Warner Istruments | CL-100 | |
Liquid cooling System | Warner Instruments | LCS-1 |