Summary

애벌레 Zebrafish의에 대한 패러다임을 먹이 고 지방 : 수유, 라이브 영상, 식품 섭취의 정량화

Published: October 27, 2016
doi:

Summary

Zebrafish are emerging as a valuable model of dietary lipid processing and metabolic disease. Described are protocols of lipid-rich larval feeds, live imaging of dietary fluorescent lipid analogs, and quantification of food intake. These techniques can be applied to a variety of screening, imaging, and hypothesis driven inquiry techniques.

Abstract

Zebrafish are emerging as a model of dietary lipid processing and metabolic disease. This protocol describes how to feed larval zebrafish a lipid-rich meal, which consists of an emulsion of chicken egg yolk liposomes created by sonicating egg yolk in embryo media. Detailed instructions are provided to screen larvae for egg yolk consumption so that larvae that fail to feed will not confound experimental results. The chicken egg yolk liposomes can be spiked with fluorescent lipid analogs, including fatty acids and cholesterol, enabling both systemic and subcellular visualization of dietary lipid processing. Several methods are described to mount larvae that are conducive to short- and long-term live imaging with both upright and inverted objectives at high and low magnification. Additionally presented is an assay to quantify larval food intake by extracting the lipids of larvae fed fluorescent lipid analogs, spotting the lipids on a thin layer chromatography plate, and quantifying the fluorescence. Finally, critical aspects of the procedures, important controls, options for modifying the protocols to address specific experimental questions, and potential limitations are discussed. These techniques can be applied not only to focused, hypothesis driven inquiries, but also to a variety of screens and live imaging techniques to study dietary lipid metabolism and the control of food intake.

Introduction

소장식이 지질 처리를 규제하는 메커니즘은 간 복합 지질 단백 합성 및 대사 조절, 이들 기관은 음식 섭취를 조절하는 중추 신경계 작동 방법 불완전하게 이해된다. 또한 비만, 심혈관 질환, 당뇨, 비 알코올성 지방간 질환의 현재 유행의 빛이 생물 해명 생의학 관심사이다. 세포 배양에서 연구와 마우스는식이 지질과 질병, 그리고 제브라 피쉬 (다니오 레 리오) 사이의 역학적 관계에 대한 우리의 이해의 대부분을 제공 한이 작품을 보완하는 이상적인 모델로 부상하고있다.

제브라 피쉬는 높은 척추 동물 1, 2와 유사한 위장관 (GI) 기관, 지질 대사 및 지질 단백질 수송을 신속하게 개발 및 유전자 다루기 쉬운입니다. 애벌레 제브라 피쉬의 광학 선명도가 생체 내 연구에 용이하게하는 particula그 외 환경로 GI 시스템의 연구 연구의 장점 (즉, 담즙, 미생물은 내분비 시그널링)은 생체가. 따라서, 유전자 취급 용이성 및 conduciveness 조합 연구의 본체와 제브라 애벌레의 촬상 라이브 모델 사실상 불가능 식이 조작 (고지방 3,4, – 콜레스테롤 5, -carbohydrate 다이어트 6,7), 심혈관 질환 (8) 모델의 다양한 당뇨 9, 10, 간 지방증 11-13, 비만 14-16, 신진 대사 통찰력의 호스트를 제공하기 위해 등장하고있다.

대사 연구로 유생 전환 지브라 피쉬의 중요한 양태는 제브라 피쉬와의 고유의 장점을 활용할 새로운 분석법의 개발에 다른 모델 동물 개발 기술의 최적화이다. 이 프로토콜은 기술이 LIPI 애벌레 제브라 피쉬를 공급하기 위해 개발 및 최적화 제공D가 풍부한 식사, 세포 내 해상도로 몸 전체에서식이 지질 처리를 시각화하고, 음식 섭취를 측정한다. 그것은 지방과 콜레스테롤 (지질이 ~ 닭 계란, 60 %가 중성 지방은 콜레스테롤입니다 ~ 5 %가되는 노른자, 35 %의 58 %는 인지질이 구성의 높은 수준을 포함로 닭고기 달걀 노른자는 지방이 풍부한 식사를 구성하기 위해 선택되었다 ). 제브라 피쉬 사료 및 먹이 연대는 랩 17에서 표준화되지 않은으로 닭고기 달걀 노른자는 전형적인 상업 제브라 피쉬 micropellet 식품 (~ 15 %의 지질)과 특정 지방산 종의 알려진 비율과 표준화 공급되는 장점보다 더 많은 지방을 제공합니다. 또한, 달걀 노른자에서 제공하는 형광 지질 유사체는 박층 크로마토 그래피를 통해 신진 대사를 조사, 운송 및식이 지질 (18)의 축적과 같은 중요한 염료 3 복잡한 지질에 공유 결합을 통해 모두 작용하여 지질 방울 포함 이미지 세포 성분을 시각화 (TLC) (19) </sup> 및 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) (SAF 미발표 데이타), 총 음식 섭취 20 정량적 분석을 제공한다.

Protocol

이 프로토콜은 과학 기관 동물 관리 및 사용위원회 카네기 연구소 (프로토콜 없음. 139)에 의해 승인되었습니다. 1. 동물 준비 14 시간에 28 ° C에서 성인과 애벌레 유지 : 10 시간 빛 : 어두운주기를. 쉘 무료 아테 미아 (디 캡슐 레이트, 비 부화, 14 DPF에서 시작) 및 상업 micropellets으로 하루에 두 번 성인 피드. 이 프로토콜은 AB 배경의 자연 산란에 의해 수집 6-7 DPF 유충의 사?…

Representative Results

29 ~ 31 ° C에서 로커에 공급되면, 건강 유충 (≥95 %)의 대부분이 1 시간 내에 먹는다. 계란 노른자 에멀젼을 소모하면, 애벌레 소장 컬러로 어둡게. 아주 어두운 장 2 시간 (그림 1)에서 관찰 할 수있다. 애벌레 unfed 또는 공급하지 않을 경우, 소장은 분명 남아있다. 애벌레 먹이 계란 흰자 전시 컬러로 어둡게하지 않는 팽창 장 루멘. <img alt="그?…

Discussion

여기에 설명 된 기술은 연구자, 지질이 풍부한 피드 유생 제브라 치료 라이브 유충식이 지질을 시각화 처리 한 애벌레 음식 섭취를 정량화 할 수있다. 성공을 보장하기 위해 특별한주의는 몇 가지 중요한 단계에 주어져야한다. 상업 닭고기 달걀 변화; 잠재적 인 변동성을 최소화하기 위해 우리는 오메가 -3 지방산에 대한 풍부한되지 않은 케이지가없는 닭에서 유기농 계란에 대한 모든 분석을 수?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank Meng-Chieh Shen for images, Jennifer Anderson for providing helpful comments on the manuscript, and members of the Farber laboratory for their contributions in developing these techniques. This study was funded by NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.), RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F), and F32DK096786 (J.P.O.). This content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of NIH. Additional support was provided by the G. Harold and Leila Y. Mathers Charitable Foundation to the laboratory of S.A.F and the Carnegie Institution for Science endowment.

Materials

Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) Sigma-Aldrich A5040-25G Anesthesia for larval zebrafish
Chicken eggs N/A N/A Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids
Ultrasonic processor 3000 sonicator Misonix, Inc. S-3000 To make egg yolk liposomes
Sonabox acoustic enclosure Misonix, Inc. 432B To make egg yolk liposomes
1/8” tapered microtip Misonix, Inc. 419 To make egg yolk liposomes
Amber vials (4 ml, glass) National Scientific 13-425 Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa
Incu-Shaker Mini  Benchmark 1222U12 Incubated shaker for feeds
BODIPY FL C16  Thermo Fisher Scientific D3821 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid)
BODIPY FL C12  Thermo Fisher Scientific D3822 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid)
BODIPY FL C5  Thermo Fisher Scientific D3834 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid)
BODIPY FL C5 Thermo Fisher Scientific D2183 Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid)
TopFluor cholesterol  Avanti Polar Lipids Inc. 810255 Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol
Fatty acid-free BSA Sigma-Aldrich A0281-1G For TopFluor cholesterol solubilization
Methyl cellulose Sigma-Aldrich M0387 Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm
Low melt agarose Thermo Fisher Scientific BP165-25 Mounting media for live larval imaging; 22 x 30
VWR microscope slides  VWR  16004-422 Mounting larvae for live imaging
Coverslips  Cover Glass 12-544A Mounting larvae for live imaging
Super glue Loctite LOC01-30379 Mounting larvae for live imaging
FluoroDish (glass bottom dish) World Precision Instruments, Inc.  FD35-100 Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness  
Confocal microscope Leica Microsytems SP-2, SP-5 Microscope for high magnification live imaging
Stereoscope Nikon SM21500 Microscope for low magnification live imaging
Glass culture tubes  Kimble 73500-13100 Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml)
Savant SpeedVac Plus  ThermoQuest SC210A Lipid extraction
Channeled TLC plates Whatman Scientific WC4855-821 Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued
Channeled TLC plates Analtech, Inc. 66911 Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates
Typhoon 9410 Variable Mode Imager GE Healthcare 9410 Fluorescent plate reader for food intake assay
ImageQuant software GE Healthcare 29000605 Analysis of food intake assay
5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets    Kimble 63A53WT Transfering larvae

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Citar este artigo
Otis, J. P., Farber, S. A. High-fat Feeding Paradigm for Larval Zebrafish: Feeding, Live Imaging, and Quantification of Food Intake. J. Vis. Exp. (116), e54735, doi:10.3791/54735 (2016).

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