Identifying novel drug targets that transition from pre-clinical testing to human trials is a scientific priority. To that end, here we describe a functional genomics approach for examining the impact of gene depletion on cancer cell line spheroids, which more appropriately model human cancers in vivo.
Identifieringen av funktionella förar händelser i cancer är av central betydelse för att främja vår förståelse av cancerbiologi och oumbärlig för upptäckten av nästa generation av nya läkemedelsmål. Det blir uppenbart att mer komplexa modeller av cancer krävs för att till fullo uppskatta de bidragande faktorerna som driver tumörbildning in vivo och öka effektiviteten av nya terapier som gör övergången från prekliniska modeller för kliniska prövningar.
Här presenterar vi en metod för att generera likformiga och reproducerbara tumör sfäroider som kan utsättas för siRNA funktionell screening. Dessa sfäroider uppvisar många egenskaper som finns i fasta tumörer som inte är närvarande i traditionell två-dimensionen kultur. Vi visar att flera vanliga linjer bröstcancerceller är mottagliga för detta protokoll. Dessutom ger vi proof-of-principle-data utnyttjar bröstcancer cellinje BT474, bekräftar derasberoendet av amplifiering av den epidermala tillväxtfaktorreceptorn HER2 och mutation av fosfatidylinositol-4,5-bifosfat 3-kinas (PIK3CA) när den odlas som tumör sfäroider. Slutligen har vi möjlighet att ytterligare undersöka och bekräfta den rumsliga effekterna av dessa beroenden använder immunhistokemi.
Solida tumörer uppvisar betydande histologiska, genetiska och mikromiljö inom tumör heterogenitet, som presenterar kliniker med en stor utmaning i att kunna behandla patienter med framgång. Majoriteten av modeller som används för att identifiera nya riktade terapier inte införliva många av dessa funktioner. I själva verket har aktuella riktade terapier som används i kliniken utvecklats under det senaste decenniet som använder screeningmetoder som är beroende av cancercellinjer som odlats under tvådimensionella (2D) odlingsbetingelser. Även om detta har lett till olika framgångar, såsom receptor tyrosinkinashämmare, blir det uppenbart att mer komplexa modeller av cancer krävs för att till fullo uppskatta de bidragande faktorerna som driver tumörbildning in vivo och öka antalet nya behandlingsmetoder som gör övergången från prekliniska modeller till kliniska prövningar. Dessutom är det nu mycket uppskattat att 2D odlingssystem inte återspeglavivo beteende 1,2. Till exempel, i dåligt vaskulariserade tumörer, eftersom efterfrågan på syre och näringsämnen inom mikromiljön överstiga tillgången, regioner av höga och låga leveranser utvecklas. Förekomsten av låg syrehalt (hypoxi) i tumörer, som detekteras genom immunhistokemisk färgning av tumörsnitt för etablerade hypoxiska markörer som karbanhydras IX (CAIX), korrelerar med en sämre kliniska resultat i bröstcancer 3,4 Således innehåller funktioner som hypoxi i screening-modeller kan öka vår förmåga att upptäcka nya läkemedel mål som kommer att bli mer effektiva in vivo. Faktum är att framgångsrikt inriktade aggressiva tumörer som innehåller hypoxi är en klinisk prioritet 5.
Den ändring av traditionella 2D siRNA screening, i ett försök att mera exakt sammanfatta delar av de förhållanden som råder av cancerceller i tumören mikro har lett till identifiering av flera gener thåtmin har befunnits vara viktiga för tumörtillväxt in vivo. Dessa inkluderar funktionella genomiska skärmar utförs under låga serumförhållanden 6, hypoxiska betingelser 7 och i kombination 8. Till exempel, tystande av 6-Phosphofructo-2-kinas / fruktos-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), ett protein som ansvarar för reglering av kol som kommer glykolys, endast inducerade apoptos i prostatacancerlinjer härledda från metastaser vid odling i lågt serum. Tysta PFKFB4 i normala prostatacellinjer under samma betingelser hade ingen effekt, medan utarmning av PFKFB4 helt avlägsnade tillväxten av prostatacancer cellinje xenotransplantat 6.
I en utvidgad panel av bröstcancercellinjer, den tysta mono-karboxylas transportör 4 (MCT4) företrädesvis ledde till en minskning av celltillväxt under förhållanden med låg syrehalt. Denna sårbarhet validerades in vivo i bröstcancer cellinje ortotropisk xenografts. Kanske mest slående, tysta av acetyl-CoA-syntetas 2 (ACSS2), ett enzym som ansvarar för konvertering av acetat till acetyl-CoA, minskad cancercell nummer under näringsstressförhållanden (låg syrehalt och serum) men hade liten eller ingen effekt under normala odlingsbetingelser 8. Ablation av ACSS2 påverkade tillväxten av bröst- och prostatacancer xenografter tyder på att närings gradienter inte existerar isolerat inom tumören mikro och att celler som finns i dessa regioner är avgörande för tumörprogression 8. Vidare ACSS2 konstaterades också att vara viktiga i glioblastom och hepatocellulära karcinom 9,10, vilket tyder på att ökad ACSS2 aktivitet i tumörer kan vara en grundläggande mekanism som stöder tillväxt under ogynnsamma förhållanden.
Sammantaget visar dessa studier visar att rekapitulera de förhållanden som förekommer in vivo och utföra siRNA skärmar tillåter för identifiering av genes väsentliga för cancer överlevnad. Samt impac 2D cancercelltillväxt enligt näringsstressförhållanden, förbrukning av målgener i dessa studier inhiberade cancercellinje sfäroid tillväxt, spegling vad som observerades i tumörxenotransplantat 6,8. Således, cancer cellinje sfäroiderna innehåller flera av de förhållanden som råder i tumören mikro som förlänar känslighet för ACSS2 tysta. I själva verket, sfäroider visar närings gradienter (serum och syre), förändringar i pH, tredimensionella (3D) cell-cellkontakt, men också förändringar i proliferativ celerity med celler som genomgår cellcykeln och apoptos. Detta exemplifieras genom närvaron i cancer sfäroider av nekrotiska regioner, en funktion som inte finns i traditionella 2D kultur.
Cancercell sfäroider har redan använts som mer biologiskt relevanta modeller för att screena småmolekylinhibitorer men detta endast tillåter validering av föreningen effektivitet eller återanvända av kompoFONDERNA ursprungligen design för andra sjukdomar 11. Nuvarande sfäroid screeningmetoder tillåter inte för analys av specifika genen utarmning i en hög genomströmning av hög halt sätt. Här beskriver vi för första gången, en funktionell genomik rörledning för att avslöja specifik gen beroenden använder små störande RNA (siRNA) teknik i cancercell linje sfäroider. Vi har utformat en skräddarsydd bibliotek med siRNA riktar de 200 mest muterade gener i humana bröstcancer och bedömde effekterna av genen utarmning på sfäroid storlek och metabolisk aktivitet i BT474 bröstcancer sfäroider. Vi kunde robust och reproducerbart detektera effekterna av ErbB2 och PIK3CA tysta i 3D kulturer. Dessutom kunde vi bedöma effekten av genen utarmning på den rumsliga arkitektur BT474 sfäroider med hjälp av immunohistokemi.
Tredimensionella modeller av cancer alltmer används för att utvärdera effekten av kända och nya föreningar som har utformats för att selektivt döda cancerceller. Cancercell sfäroider är strukturer som visar förhållanden som mer liknar de som förekommer i tumörer in vivo, således föreningar som har ökad effektivitet i 3D är mer benägna att ha en effekt in vivo. Men dessa omständigheter inte tillåter för identifiering av potentiellt nya mål som inte har varit föremål för läkemedelsdesign som skulle kunna ha en betydande effekt vid behandling av cancer.
Vi utvecklade en siRNA funktionsgenomik tillvägagångssätt som tillåts för hållbara geners uttryck för upp till sju dagar i cancer cellinjer sfäroider. Det finns flera viktiga steg i protokollet som kräver optimering innan siRNA skärm kan utföras. Förmågan att bilda reproducerbara viabla sfäroider i stor skala är viktigt. Dessutom är ettppropriate transfektion villkor bör noggrant optimeras. Vi föreslår trialing flera olika transfektionsreagens med lämpliga icke-inriktning och döda kontroller innan du försöker skärmen. Vi kunde visa att flera vanliga bröstcancercellinjer, nämligen BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 och JIMT1 var mottaglig för siRNA transfektion. Dessutom ger vi proof-of-principle-data screening de 200 mest muterade gener i bröstcancer i BT474 sfäroider bekräftade sitt beroende av förstärkning av HER2 och onkogen mutation av PIK3CA. Intressant, tysta transkriptionsfaktor FOXO3 resulterade i en minskning av sfäroid storlek men ingen signifikant effekt på lönsamheten. FOXO3 är känd för att reglera svaret på hypoxi, förändra den metaboliska kapaciteten av cancerceller så att de kan anpassa sig lättare till sin omgivning 16. Denna roll skulle kunna störa cellviabilitet behandlingen eftersom den detekterar ATP överflöd, En av de viktigaste produkterna av cellmetabolism.
Till stöd för observation av en minskning av sfäroid storlek, har det visat sig att tysta FOXO3 i HeLa xenografter nedsatt tumörtillväxt och apoptos 17. Det är viktigt att notera att vissa gener kan påverka förmågan hos cancerceller att behålla sin 3D-arkitektur, vilket kan resultera i falska positiva. Till exempel, knockdown av E-cadherin resulterade i upplösning av BT474 sfäroid struktur. Detta hade tidigare rapporterats med hjälp av E-cadherin riktade antikroppar 18. Som med alla screening plattform, bör potentiella mål att återscreenades för att bedöma reproducerbarhet av effekten observerades. Det finns begränsningar för tekniken, nämligen övergående natur siRNA-medierad gen knockdown. Ihållande tysta längre än sju dagar var inte kan uppnås med siRNA.
Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det kan kopplas med olika andra Biometric färgämnen inte bara de som bedömer sfäroid lönsamhet, till exempel, ger rumslig information om sfäroid hypoxi eller övervakning celler som genomgår apoptos. Dessutom, på grund av plattläsaren skannar är relativt snabb och icke-invasiv, effekterna av siRNA på sfäroid storlek kan bedömas över tiden snarare än bara på experiment slutpunkt. I själva verket är vi undersöker för närvarande flera av dessa möjligheter inom vår screening pipeline. Ett alternativt tillvägagångssätt, som utnyttjar 3D-kulturer för att identifiera nya beroenden är användningen av kemiska bibliotek som hämmar antingen ett brett spektrum av mål eller speciella familjer av proteiner. Faktiskt, Bitler et al. utnyttjat denna målinriktad strategi för att identifiera interaktion den syntetiska dödlighet mellan ARID1A status och EZH2 inhibitorer i äggstocks klara cellcarcinomas 19. Upptäckten av crispr-Cas9 gen redigering teknik har också gjort det möjligt att utveckla genetiska skärmar i organoid kulturer och in vivo. Emellertid thans inställning är beroende av att ha lämpliga djuranläggningar och kan kosta oöverkomliga 20.
Sammanfattningsvis anser vi att vi har beskrivit ett protokoll som bättre modeller syre- och närings gradienter, som är karaktäristiska för tumörmikro in vivo, som möjliggör identifiering av nya mål cancer eller robust validering av uppsatta mål. Dessutom kan våra protokoll kan tillämpas på alla typer av cellinje som bildar sfäroider och därmed kan rutinmässigt används i cancerforskning community för hög genomströmning siRNA skärmar.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Fredrik Walberg (FACS and imaging facility, ICR) for assistance with microscopy. This work was funded by Breast Cancer Now. RN is the recipient of a Breast Cancer Now Career Development Fellowship (2011MaySF01).
Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
Pipette tips (200ul) | Starlab | S1111-0806 | |
Pipette tips (10ul) | Starlab | S1111-3800 | |
Pipette tips (1000ul) | Starlab | S1122-1830 | |
Serological pipettes (5ml) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
Serological pipettes (10ml) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
Serological pipettes (25ml) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
Celigo S | Nexcelom | contact company | |
Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
Benchtop centrifuge | Various | ||
Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
Tissue culture C02 Incubator | Various | ||
Mulitichannel pipette | Various |