विकासवादी परिदृश्यों में वर्गीकरण (स्थानिक अलगाव) की भूमिका प्रयोगशाला है कि स्थानिक वितरण के समायोजन नियंत्रित अनुमति देने में सरल माइक्रोबियल सिस्टम का उपयोग कर जांच की जा सकती है। संस्थापक सेल घनत्व को संशोधित करके, विभिन्न स्तरों वर्गीकरण बेसिलस subtilis की कॉलोनी biofilms में fluorescently लेबल जीवाणु उपभेदों का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं।
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
पिछले दशकों में, रोगाणुओं पृथ्वी 1,2 पर विभिन्न पारिस्थितिक तंत्र के साथ जुड़े सामाजिक समुदायों के रूप में मान्यता दी गई है। planktonic सामान्य प्रयोगशाला अभ्यास में इस्तेमाल संस्कृतियों के विपरीत, वातावरण में रोगाणुओं पारिस्थितिक सेटिंग के आधार पर स्थानिक संरचनाओं समुदाय की एक विविध रेंज दिखा। सरल माइक्रोबियल प्रणालियों सामाजिक संबंधों 3,4 के विकास पर स्थानिक संरचनाओं का परिणाम समझने के लिए उपयोग किया जा सकता है। दोनों यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हुए पिछले 2-3 वर्षों में प्रकाशन माइक्रोबियल आबादी 5-8 के भीतर सहयोग की स्थिरता पर स्थानिक संरचनाओं के प्रभाव पर प्रकाश डाला। इसके अतिरिक्त, चयापचय पार खिला रोगाणुओं के बीच बातचीत लाचार, जैसे, भी बातचीत भागीदारों 9-11 के स्थानिक वितरण बदल सकता है। इन अध्ययनों में स्थानिक संरचना के प्रभाव ज्यादातर सतह संलग्न बिना डंठल इसलिए inhabiting कोशिकाओं का उपयोग कर जांच कर रहा हैतथाकथित biofilms या कालोनियों में अगर मध्यम की सतह पर बढ़ रहा है। जेनेटिक बहाव उच्च स्थानिक वर्गीकरण में जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोबियल कालोनियों में देखा जा सकता है जहां आनुवंशिक बाधाओं की श्रृंखला में एक कोशिका विभाजन की मध्यस्थता विस्तार परिणामों की बढ़त है कि कुछ प्रतिरूप linages 12 के लिए उच्च स्थानीय निर्धारण संभावना का कारण बनता है पर पोषक तत्वों की कमी। जेनेटिक बहाव इसलिए माइक्रोबियल कालोनियों में स्थानिक अलगाव की भूमिका की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।
वातावरण में, biofilms स्वयं उत्पादित बहुलक मैट्रिक्स 13 से घिरा हुआ multispecies समुदाय हैं। Biofilm संरचना, समारोह और स्थिरता सामाजिक संबंधों का एक जटिल नेटवर्क जहां बैक्टीरिया विनिमय का संकेत है, मैट्रिक्स घटकों और संसाधनों, या स्थान के लिए प्रतिस्पर्धा और विषाक्त पदार्थों और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर पोषक तत्वों। बेसिलस subtilis एक मिट्टी रहने वाली और जड़-बस्तियां जीवाणु कि उच्च का आयोजन विकसित करता है पर निर्भर biofilm समुदायों 14। सामाजिक करने के सादृश्य मेंकीड़े, बी subtilis कोशिकाओं श्रम रणनीति का एक प्रभाग को रोजगार, बाह्य मैट्रिक्स उत्पादकों और नरभक्षी, गतिशील कोशिकाओं, निष्क्रिय बीजाणुओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं 15,16 के उप-जनसंख्या का विकास। भेदभाव की प्रक्रिया गतिशील है और पर्यावरण की स्थिति 17,18 से बदला जा सकता है।
बैक्टीरिया से सतह उपनिवेशवाद की रणनीतियाँ आसानी से विकास मीडिया में अगर एकाग्रता को संशोधित करके प्रयोगशाला परिस्थितियों में चालाकी से किया जा सकता है। कम अगर स्तर (0.2-0.3%) में सक्रिय flagella शरण बैक्टीरिया, तैरने में सक्षम हैं, जबकि अर्द्ध ठोस अगर (0.7-1% अगर) की सुविधा कशाभिका संचालित समुदाय के प्रसार, 19-21 रेंगनेवाले बुलाया। कशाभिका के अभाव में, कुछ जीवाणु उपभेदों रपट, यानी विकास निर्भर आबादी विस्तार exopolysaccharide मैट्रिक्स और अन्य स्रावित hydrophobin यौगिकों 22-24 द्वारा सुविधा के माध्यम से अर्द्ध ठोस मध्यम पर स्थानांतरित करने में सक्षम हैं। अंत में, जीवाणु जो capabl हैंbiofilm विकास प्रपत्र मुश्किल अगर मध्यम (1.2-2%) 14,17,25 पर वास्तुकला जटिल कालोनियों के ई। ये लक्षण ठीक प्राकृतिक निवास में, की स्थिति का समायोजन करके प्रयोगशाला में जांच कर रहे हैं जबकि इन सतह फैल रणनीतियों पारगमन एक से धीरे-धीरे एक और पर्यावरण की स्थिति 26 के आधार पर हो सकता है। जबकि एकल कोशिका आधारित गतिशीलता दोनों ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और -नकारात्मक 27, बी के जटिल कॉलोनी biofilms में हवा तरल इंटरफेस में biofilm विकास की दीक्षा के दौरान महत्वपूर्ण है subtilis कशाभ गतिशीलता 28 का विलोपन से प्रभावित नहीं हैं। बी के विकास के दौरान हालांकि, स्थानिक संगठन subtilis कॉलोनी biofilms जीवाणु biofilm 8 आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया inoculum के घनत्व पर निर्भर करता है।
यहाँ, हम बी का उपयोग subtilis दिखाने के लिए कि सतह उपनिवेशवाद के दौरान स्थानिक अलगाव जनसंख्या के स्तर motili के तंत्र पर निर्भर करता हैTy (यानी रेंगनेवाले या फिसलने), और कॉलोनी biofilm विकास संस्थापक सेल घनत्व पर निर्भर करता है। हम एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी उपकरण है कि लगातार माइक्रोबियल biofilm विकास, सतह उपनिवेशवाद और मैक्रो पैमाने पर वर्गीकरण की निगरानी के लिए लागू किया जा सकता उपस्थित थे। इसके अलावा, एक मात्रा का ठहराव विधि आबादी में रिश्तेदार तनाव बहुतायत निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत किया है।
बैक्टीरिया के लिए एक फ्लोरोसेंट उपकरण बॉक्स की उपलब्धता न केवल विषम जीन अभिव्यक्ति 30,31 और प्रोटीन स्थानीयकरण 32 के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी एक जनसंख्या 8 भीतर उपभेदों के स्थानिक वितरण के विश्लेषण की सुविधा। पर्याप्त अलग उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ फ्लोरोसेंट मार्करों साफ़ तौर पर दो उपभेदों कि अन्यथा जब मिश्रित एक दूसरे से पृथक कर रहे हैं स्थानीयकरण करने के लिए अनुमति देते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल उपभेदों या प्रजातियों के बीच मिश्रित संस्कृतियों में जनसंख्या गतिशीलता, जैसे प्रतियोगिता प्रयोगों या सहकारिता के अवलोकन के लिए नियोजित किया जा सकता है। रिश्तेदार प्रचुरता के fluorescently एक मिश्रित आबादी में लेबल उपभेदों निर्धारित करने की क्षमता जुड़ी रेंगनेवाले, रपट, या biofilm कालोनियों सतह तक ही सीमित नहीं है, लेकिन जलमग्न सहित अन्य बहुकोशिकीय biofilm सिस्टम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रवाह सेल या हवा-मध्यम इंटरफ़ेस 27,33-35 biofilms।
_content "> प्रस्तुत तकनीक तनाव और डिजाइन प्रतियोगिता प्रयोगों के स्थानिक वितरण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह भी विस्तार कालोनियों में जीन की अभिव्यक्ति विविधता निम्नलिखित अनुमति देता है। संवर्धन यहाँ वर्णित शर्तों बी subtilis और पर विस्तार के लिए सटीक मापदंडों के लिए आवेदन जबकि इमेजिंग प्रयोगकर्ता परमिट समय में जनसंख्या गतिशीलता का पालन करने के लिए अगर मीडिया अन्य प्रजातियों या उपभेदों 20 के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक ऊष्मायन चैम्बर में नमूने रखकर, हालांकि ध्यान ऊष्मायन के दौरान कक्ष के भीतर नमी का स्तर को दी जानी चाहिए।इतना है कि उपभेदों फ्लोरोसेंट मार्करों जो एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता अभिव्यक्त तकनीक यहाँ वर्णित भी जांच जीवाणु उपभेदों की आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता है। इसके अलावा, अलग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा होने के अलावा, यह सिफारिश की है कि चुने गए दो फ्लोरोसेंट मार्करों समान क्वांट हैउम पैदावार और एक तुलनीय स्तर में व्यक्त कर रहे हैं (अवशोषित फोटॉनों कि उत्सर्जित कर रहे हैं यानी अनुपात)। इसके अलावा, समय में रिश्तेदार तीव्रता परिवर्तन मापा जाता है और एक प्रयोग के लिए एक प्रारंभिक समय बिंदु के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। रिश्तेदार वृद्धि या कमी तो अलग क्वांटम क्षमता के साथ विभिन्न fluorophores के बीच तुलना की जा सकती। प्रस्तुत प्रायोगिक प्रणाली के लिए, विभिन्न ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले सबसे इष्टतम फ्लोरोसेंट जोड़े कि बी में पता लगाया जा सकता है के लिए चयन करने के लिए 36,37 परीक्षण किया गया subtilis। इष्टतम जोखिम समय प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और नमूने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। निश्चित सेल घनत्व या कोशिकाओं के कई परतों आबादी के भीतर कुशलतापूर्वक संकेत का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है। कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीन अक्षम अभिव्यक्ति और / या प्रोटीन का अनुवाद है और इस तरह कम क्वांटम उपज के कारण बैक्टीरियल कोशिकाओं में कम तीव्रता हो सकता है। इस तरह अक्षम फ्लोरोसेंट मार्करों सकता है rप्रणाली की संवेदनशीलता निष्कर्ष निकालना और समय जीवाणु उपभेदों संभवतः उत्तेजना प्रकाश द्वारा cytotoxicity में जिसके परिणामस्वरूप पता लगाने के लिए की जरूरत का विस्तार। फ्लोरोसेंट तीव्रता तदनुसार फ्लोरोसेंट रिपोर्टर कोडिंग जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर बदलकर संशोधित किया जा सकता है। एक अभिव्यक्ति स्तर बहुत अधिक है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवाणु के लिए हानिकारक फिटनेस लागत के लिए अग्रणी के अनावश्यक overproduction में परिणाम सकता है। जब प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन, एक की कोशिकाओं में विशेष फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन की लागत पर विचार करना चाहिए। नियंत्रण प्रयोगों, जहां फ्लोरोसेंट मार्करों प्रतिस्पर्धा उपभेदों या जहां दो isogenic उनकी फ्लोरोसेंट मार्करों में ही अलग-अलग उपभेदों एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं के बीच बदली हैं, हमेशा एक मार्कर की ओर किसी भी पूर्वाग्रह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का जीवन काल भी मापा तीव्रता प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, कुछ जीवाणु नकदी के autofluorescenceअलग फ्लोरोसेंट यहाँ वर्णित के अलावा अन्य मार्कर के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है।
ठीक स्थानिक वितरण और विशिष्ट जीवाणु उपभेदों की प्रचुरता का निर्धारण करने के लिए, पृष्ठभूमि संकेत पहले फ्लोरोसेंट प्रोटीन से होने वाले है, जबकि दूसरा फ्लोरोसेंट मार्कर और इसके विपरीत के लिए प्रतिदीप्ति फिल्टर का उपयोग व्यक्तिगत रूप से (मोनोकल्चर नमूनों पर परीक्षण किया जाना चाहिए केवल एक मार्कर के उत्पादन बैक्टीरिया युक्त )। इस फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता ओवरलैपिंग के घटाव की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, stereomicroscope के विस्तार कॉलोनी के ऊपर से प्रतिदीप्ति संकेत रिकॉर्ड के रूप में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुविधाजनक दो आयामों में स्थानिक व्यवस्था निर्धारित करने के लिए है। विस्तार हो बैक्टीरियल आबादी की वास्तुकला बदलती प्रतिदीप्ति के स्तर में परिणाम सकता है (यानी शिकन संरचनाओं की तरह अधिक से अधिक स्थानीय प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित कोशिकाओं हो सकते हैं)। इसलिए, छवियों का वर्णन किया गया विश्लेषण घस्थानिक वितरण नहीं, बल्कि एक निश्चित स्थान के भीतर उपभेदों की बहुतायत etermines। पिछले प्रोटोकॉल बैक्टीरियल कालोनियों 38 में जनसंख्या गतिशीलता के 20 या प्रतिदीप्ति इमेजिंग झुंड के लिए नमूना तैयार करने में वर्णित है, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल इन तकनीकों को जोड़ती है। अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जनसंख्या संरचना के तीन आयामी संकल्प (जैसे लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग 39,40 या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 41) के अवलोकन की अनुमति वृद्धि हुई संरचनात्मक जटिलताओं के साथ नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। इन अतिरिक्त तकनीक भी उपभेदों 31 कि stereomicroscopes का उपयोग कर उपलब्ध नहीं है की एकल कोशिका आधार पर पता लगाने समर्थन करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान KO4741 / 3-1 से वित्त पोषित किया गया। इसके अलावा, Á.TK की प्रयोगशाला एक मैरी क्यूरी Skłodowska कैरियर एकीकरण अनुदान (PheHetBacBiofilm) द्वारा समर्थित और DFG से KO4741 / 2-1 अनुदान दिया गया था। वें, ई, आरजी एम।, और ईएम अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल, अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन, Consejo नैशनल डे Ciencia y Tecnologia-जर्मन शैक्षणिक विनिमय सेवा (CONACYT-डीएएडी), और JSMC फैलोशिप, क्रमशः द्वारा समर्थित थे।
Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
KCl | any | NA | |
MgSO4 7H2O | any | NA | |
Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
MnCl24H2O | any | NA | |
FeSO4 | any | NA | |
D-Glucose | any | NA | |
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
Softwares | |||
Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
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