This protocol describes a simple Hybrid-Cut tissue sectioning method that is useful for recalcitrant plant tissues. Good quality tissue sections enable anatomical studies and other biological studies including in situ hybridization (ISH).
植物の部分の整合性を維持することは、セルラー、組織、あるいは臓器レベルでの詳細な解剖学的構造を研究するために不可欠です。しかし、いくつかの植物細胞は、硬い細胞壁、強靭な繊維および結晶を有します (シュウ酸カルシウム、シリカ、 等 )、及び高い含水量は、多くの場合、植物組織切片中の組織の完全性を破壊すること。
本研究では、単純なハイブリッドカット組織切片法を確立します。このプロトコルは、パラフィン系切片法を修正し、異なる植物からの組織切片の完全性を改善します。植物組織は、-16℃の低温槽に切片の前にパラフィンに包埋しました。パラフィンブロック、減少引き裂きや引っかき傷、および大幅に改善組織の完全性は、低温で硬化セクショニング。このプロトコルは、成功したシュウ酸カルシウムが豊富な胡蝶蘭の組織ならびに生殖orgaがなどの反抗組織に適用し、NS、米、トウモロコシ、小麦の葉。また、ハイブリッドカットからの組織切片の高品質は、目的の遺伝子の空間的発現パターンを提供するために、in situハイブリダイゼーション(ISH) にと組み合わせて使用することができます。結論として、このプロトコルは、高結晶またはシリカ含有量を含む応性植物組織に特に有用です。良質の組織切片は、形態学的および他の生物学的研究を有効にします。
パラフィン系セクショニング方法は、解剖学的研究のために広く使用される技術です。無傷の組織の解剖学的構造の保存は形態学的および生物学的研究のために重要です。パラフィン包埋の細胞及び組織形態学を保持するためのパラフィン包埋切片の技術が有利です。また、パラフィンブロックは、長期間にわたって都合よく保存することができます。しかしながら、パラフィン包埋切片は、細胞内の結晶を含有する植物組織には適していません。細胞内の結晶は、多くの場合、切片中にパラフィンリボンや損傷組織の整合性を引き裂きます。
パラフィン切片とは異なり、凍結切片は比較的高速であり、セクションは、固定、シリアル脱水または培地浸透1を埋め込むことなく得ることができます。凍結切片は、免疫組織化学、in-situでのハイブリダイゼーション、および酵素組織化学などの多くのアプリケーションと互換性があります。凍結切片の他の利点はこの方法は、このような高温や化学処理などの潜在的な変性過程を経由しないということなので、細胞分子は、よく組織切片2内に保存されています。凍結切片は、一般に、パラフィン系、動物組織中の研究のために切片よりも好ましいです。温度を凍結することは、時にはセクションの整合性の品質に影響を与える氷結晶の形成を引き起こすためしかし、凍結切片は、植物の最初の選択肢ではありません。スクロース溶液、ポリエチレングリコール(PEG)、またはグリセロール3などの浸透圧調節は、凍結条件下での結晶の氷の形成を減少させることが報告されているが、改善が最適未満です。
異なる環境に適応するために、異なる植物は、多くの場合、別個の組織の質感および植物細胞は、剛性の細胞壁、タフな繊維、および結晶4,5を形成するために進化してきています。例えば、不溶性シュウ酸カルシウム結晶とシリカ体はではかなり一般的です植物6。ケイ酸体/結晶は、植物構造を維持するのを助ける直立、および穀類植物7-9に病気や害虫を防ぐことが報告されています。
鉢植えの蘭とカット花蘭の市場が繁栄され、それが成長産業である。 胡蝶蘭のアフロディーテ (コチョウラン)は台湾で最も重要な輸出観賞用植物の一つです。重要な努力が胡蝶蘭で開花プロセスの形態学的および生理学的変化を理解するために行われてきました。 胡蝶蘭の花のスパイクは、葉の基部の腋芽から開始されます。クールな周囲温度(約1ヶ月半)の期間の後、腋芽は休眠を破る、拡大、若い花のスパイクに発展するために葉の基部から突出しています。生理学的な、細胞、およびスパイク開始の分子プロセスを理解するために、visuaに強固な解剖学的な技術の開発が不可欠ですタイムリーに平安大町組織またはマーカー。しかし、蘭の組織におけるユビキタス結晶の存在は、特に腋芽に、解剖学的作業を困難にしています。
ここでは、これまで技術的に困難であると見なされてきた手に負えない植物組織のセクションの整合性を改善しようとしました。ここでは、ハイブリッドカットという名前の改良されたプロトコルを示します。これは、クライオスタットを用いて実行されるパラフィン系切片法です。パラフィン包埋は、植物組織における高い水分含有量を解決します。パラフィンブロックを低温で硬化切片、問題を引き裂く結晶が減少し、大幅な組織の完全性を改善します。このプロトコルは、かなり扱いにくい植物試料のための組織の整合性を向上させます。
植物細胞は、植物組織切片中の組織の裂けの問題を引き起こす堅い細胞壁、厳しい繊維、結晶、及び高い水分含量を有します。パラフィン系切片が頻繁に植物組織のために使用されるにもかかわらず、内因性の結晶を多くの場合( 図1)切片中に植物組織を切ります。そのため、植物細胞内で本質的に高い水分含有量の、クライオスタットベースの切片は、多くの場合、壊れた細胞を引き起こし、組織切片を割りました。
本研究では、ハイブリッド・カットという名前の組み合わせ、パラフィン包埋し、凍結切片プロトコルが開発され、良質の組織切片を得ました。このプロトコルは、パラフィン包埋を導入することにより、高い水分含有量に関連した問題を解決し、( 図3)を切片中に低温下でパラフィンワックスを硬化させることにより引き裂き影響を低減します。したがって、この修正されたプロトコルのいずれかパラフィン系切断面上有利です。寧または植物組織の完全性を維持するための凍結切片。
この原稿は、ハイブリッドカット法は、結晶( 図 3-4)の高レベルを含むなど腋芽、種子、およびPLB、などの胡蝶蘭の多くの組織において組織の完全性を保持することを示しています。また、このプロトコルは、このような高シリカ( 図5-6)が含まれている生殖器官や米、トウモロコシの葉、小麦のように穀物に適しています。おそらく、このプロトコルは、高い繊維を含む植物の木質に適用することができます。
一般的には、固定組織は徹底的にハイブリッドカットのために非常に重要です。私たちは、ホルムアルデヒド-アルコール-酸性酸(FAA)固定液は、しかし、PFAは、RNAの完全性を維持する中で、FAAより良い作品PFAは等軸方向に芽、根、などのいくつかの反抗組織の組織の完全性を維持するよりも優れていることがわかりました。したがって、PFAは、修正することをお勧めしますin situハイブリダイゼーション(ISH)作業のためのサンプル。ここで説明するプロトコルは、RNA ISH実験のために設計されています。したがって、すべての試薬は、DEPC処理してRNアーゼの混入を排除することによって、RNAの分解を避けるために調製しました。ハイブリッドカット部は解剖学的な研究のためであれば、定期的に逆浸透(RO)水とその派生バッファまたは試薬が許容されます。
3mm未満に試料サイズと厚さを減らすこと浸潤のために有用です。また、脱水、浸透のための浸漬時間の増加は、硬い質感組織のために必要です。このプロトコルの制限が不十分な固定、脱水、および試料の浸透により引き起こされる問題に起因する可能性があります。したがって、各ステップの処理時間の調整は、良好な品質のパラフィンブロックを生成するために重要です。通常、硬い組織は、より柔らかい組織よりも長い処理時間を必要とします。
加えて、我々はハイブリッドカットは、組み合わせのwiで正常に働いていたことを示しました第ISHは、選択された転写物( 図7)の空間分布を提供します。要約すると、このプロトコルは、植物解剖学の研究に有用であり、選択された遺伝子の組織特異的RNAのマップを提供します。加えて、このようなターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイ、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)、および免疫染色法などの他の分子の研究に適用することができます。結論として、この改良された組織切片プロトコルは有用と植物群落の研究者に役立つの両方です。
The authors have nothing to disclose.
We are grateful to the technical support from Ms. Hong Xian Hsing, Mr. Min Jeng Li, and Mr. Eric C. P. Wu. We express our appreciation to Miranda Loney for English editing.
Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
Microtome model RM2255 | Leica | ||
Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
Sodium phosphate dibasic (NA2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |