Molekylær diffusion i plasma Membraner af primær lymfocytter målt ved fluorescenskorrelationsspektroskopi

Summary

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Abstract

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en kraftfuld teknik til undersøgelse af diffusion af molekyler i biologiske membraner med høj rumlig og tidsmæssig opløsning. FCS kan kvantificere den molekylære koncentration og diffusionskoefficient fluorescensmærkede molekyler i cellemembranen. Denne teknik har evnen til at udforske de molekylære diffusion karakteristika molekyler i plasmamembranen af immunceller i stationær tilstand (dvs. uden processer, som påvirker resultatet under selve måletid). FCS er god til at undersøge udbredelsen af ​​proteiner, som udtrykkes ved niveauer typiske for de fleste endogene proteiner. Her er en enkel og robust metode til at bestemme diffusionshastigheden af ​​cellemembran proteiner på primære lymfocytter demonstreret. En effektiv måde at udføre målinger på antistof-farvede levende celler og almindeligt forekommende observationer efter erhvervelsen beskrevet. De seneste fremskridti udviklingen af ​​foto-stabilt fluorescerende farvestoffer kan anvendes ved at konjugere antistofferne af interesse til passende farvestoffer, der ikke blege udførligt under målingerne. Desuden tillader dette til påvisning af langsomt spredende enheder, som er et fælles træk ved proteiner udtrykt i cellemembraner. Analysen procedure at udtrække molekylære koncentration og diffusion parametre fra de genererede autokorrelationsfunktioner kurverne fremhæves. Sammenfattende er en grundlæggende protokol for FCS målinger leveres; det kan efterfølges af immunologer med en forståelse af konfokal mikroskopi, men med nogen anden tidligere erfaring med teknikker til måling af dynamiske parametre, såsom molekylær diffusion satser.

Introduction

Mange immunceller funktioner er afhængige af molekylær diffusion og interaktioner inden membraner. Biologiske membraner er komplekse, og mange faktorer, der kan være vigtige for funktionen af immunceller kan påvirke hastigheden af translationelle diffusion af proteiner i cellemembraner ^1. Vi har for nylig vist, at naturlige dræberceller (NK-celler), lymfocytter, der tilhører det medfødte immunsystem, udviser differentieret diffusion af to undersøgte proteiner på cellemembranen afhængigt af tilstanden af NK-celle-aktivering ^2.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) er en teknik, der er i stand til at kvantificere molekylære diffusionshastigheder inden biologiske membraner. Det rapporterer den gennemsnitlige diffusionshastighed af fluorescensmærkede molekyler i et bestemt volumen, typisk i fokus i et konfokalt mikroskop. Den er baseret på måling af udsvingene i fluorescens, der forekomme ved molekylær bevægelse iet system i steady state. FCS har været meget anvendt til undersøgelse af diffusion af fluorescerende farvestoffer og proteiner, både i opløsning og i lipidmembraner. Andre output parametre, der påvirker diffusionshastigheden kan også indirekte undersøgt på denne måde (fx konformationelle ændringer af proteiner eller interaktioner af molekyler på cellemembraner) ^{3, 4.} FCS står i forhold til andre teknikker på grund af dens høje følsomhed, hvilket vil give mulighed for enkelt-molekyle detektion. Det fungerer godt for molekylære koncentrationer i det nanomolære til millimolære område, hvilket er typisk for endogene ekspressionsniveauer af de fleste proteiner ^5. Endvidere kan FCS giver en tilnærmelse af det absolutte antal proteiner i den undersøgte volumen, mens de fleste andre teknikker kun give relativ oplysninger om protein ekspressionsniveauerne. Andre fremgangsmåder til måling af molekylære diffusionshastigheder inden membraner indbefatter fluorescence inddrivelse efter fotoblegning (FRAP), enkelt partikel sporing (SPT), flere pinhole FCS, og image korrelation metoder. FRAP og image korrelation metoder er ensemble teknikker, som generelt ikke giver oplysninger om det absolutte antal af molekyler ^10. Sammenlignet med SPT, gennemløb af FCS er højere i forhold til at karakterisere gennemsnit befolkningen. Analysen er også mindre krævende, da den gennemsnitlige diffusionshastighed af molekylerne til stede i laserfokus måles, snarere end hastigheden af ​​enkelte molekyler. Også, medmindre specialiserede mikroskoper er tilgængelige ^11, SPT kan ikke give nogen oplysninger om koncentrationer, da standard SPT mærkning skal være meget lav til at gøre det muligt at identificere enkelte molekyler. På den anden side, FCS kræver molekylerne under behandling, til at være mobile. Det vil simpelthen ikke afsløre eventuelle formodede immobile fraktioner eller molekyler bevæger sig meget langsomt. Diffusionshastigheden af ​​molekyler,opholde sig fokus længere end ca. en tiendedel af købet tid vil ikke være korrekt repræsenteret i FCS målinger ^{3, 12.} Derfor diffusionskoefficienter indspillet af FCS tendens til at være hurtigere end diffusion satser rapporteret fra teknikker som FRAP og SPT, hvor der træffes de tæt-på-immobile og meget langsom fraktioner i betragtning. SPT vil også give en mere detaljeret beskrivelse af variabiliteten af ​​diffusion satser inden for den molekylære befolkning end FCS vil.

FCS kvantificerer udsving i fluorescens intensitet over tid inden for ophidset volumen. I tilfælde af membran målinger svarer dette til det belyste område af membranen. I dette papir, udnytter vi det faktum, at sådanne udsving er fremkaldt af molekyler udviser brownske diffusion og er således bevæger sig ind og ud af excitation volumen. Der er også flere andre mulige kilder til udsvingoner i fluorescenssignalet, såsom blinkende eller tilstedeværelsen af ​​en triplet tilstand i fluoroforer, miljømæssige virkninger, binding-uforpligtende af liganden, eller bevægelse af hele cellemembranen. Disse formodede fejlkilder skal tages i betragtning ved udformning af et FCS eksperiment for nøjagtigt fortolke resultaterne ^{12, 13.} Typisk laterale diffusionshastigheder i biologiske membraner er lav på grund af fortrængning og interaktioner, både mellem membranproteiner og mellem proteiner og cytoskelettet. Historisk set har anvendelsen af FCS i membraner således blevet hæmmet af manglen på foto-stabil fluoroforer, som er nødvendige for at undgå blegning i den forlængede transittider gennem excitation fokus ^14. Men i dag, er der masser af muligheder for egnede foto-stabil farvestoffer. Væsentlige forbedringer i detektorer og andet hardware tillader også påvisning af fluorescerende proteins og farvestoffer med lavere lysstyrke. Her, en grundlæggende protokol for anvendelse af FCS ved anvendelse murine primære lymfocytter, hvor proteinet af interesse er mærket med en fluorescerende mærkede antistof, er beskrevet. En tilgang til at passe til autokorrelationsfunktioner kurver for at ekstrahere diffusionskoefficienten og den molekylære tæthed er også vist. Protokollen har til formål at blive let efterfulgt af immunologer uden tidligere erfaring med teknikker til at studere diffusion af molekyler. Dog forventes en grundlæggende forståelse af konfokal mikroskopi (for at få denne grundlæggende forståelse, se reference ^15). Denne protokol kan relativt let tilpasses andre suspensionsceller, begge cellelinier og primære celler. For mere erfarne FCS-brugere, findes mere raffinerede analysemetoder, hvoraf nogle er beskrevet i diskussionen.

Protocol

1. Farvning for FCS Isoler murine NK-celler fra miltlymfocytter anvender magnetisk bead mærkning, som pr fabrikantens protokol 16. Brug 2-3 x 10 5 celler pr prøve for de følgende trin. BEMÆRK: Anvend negativ selektion at berige målcellepopulationen, efterlader det urørt, således at cellerne kan mærkes ved anvendelse af primære antistoffer alene. Se henvisning 2 for mere detaljerede oplysninger om celle isolation fra mus <sup class="xre…

Representative Results

Et typisk resultat vil generere en autokorrelation kurve med en transittid i området fra 10 msek til 400 msek for membranproteiner. Antallet af molekyler kan variere mellem 0,5 til omkring 200 pr um 2 for endogent udtrykte proteiner. Kontroller omhyggeligt, at CPM ikke er lavere end forventet. Dette kan betyde, at der er en påvirkning af baggrundssignalet. Som en tommelfingerregel bør CPM signalet på celler, der er godkendt til analyse ikke være lavere end 33% af CPM for …

Discussion

Denne protokol for FCS kan anvendes til vurdering af de molekylære dynamik overflademolekyler på alle typer immunceller (murine, humane eller andre arter). FCS måler spatio-temporale molekylær dynamik ned til enkelt-molekyle opløsning i levende celler. Den molekylære tæthed, samt diffusionshastigheden og klyngedannelse dynamik proteinerne af interesse, kan ekstraheres fra autokorrelationsfunktioner kurver.

Den fluorescerende mærkning er af central betydning for en vellykket FCS ekspe…

Materials

MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	–	–	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom