דיפוזיה מולקולרית פלזמה ממברנות יסודי לימפוציטים נמדד באמצעות מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי

Summary

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Abstract

מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד דיפוזיה של מולקולות בתוך ממברנות ביולוגיות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. FCS יכול לכמת את מקדם ריכוז דיפוזיה מולקולרית של מולקולות שכותרתו fluorescently בקרום התא. טכניקה זו יש את היכולת לחקור את מאפייני דיפוזיה המולקולריים של מולקולות בקרום הפלזמה של תאים חיסוניים מצב יציב (כלומר, בלי תהליכים המשפיעים על התוצאה בזמן המדידה בפועל). FCS מתאים ללימוד דיפוזיה של חלבונים כי הם לידי ביטוי ברמות אופייניות חלבונים אנדוגניים ביותר. כאן, שיטה פשוטה וחזקה כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של חלבוני קרום על לימפוציטים עיקרי באה לידי ביטוי. דרך יעילה לבצע מדידות על תאי חיים מוכתם נוגדן נפוץ תצפיות שהתרחשו לאחר הרכישה מתוארת. הפיתוחים האחרוניםבפיתוח של צבעי ניאון צילום יציב יכול להיות מנוצל על ידי conjugating הנוגדנים של עניין לנכס צבעים שאינם להלבין בהרחבה במהלך המדידות. בנוסף, זה מאפשר זיהוי של גופים להתפוגג אט אט, אשר היא תכונה נפוצה של חלבונים הביע קרום התא. הליך הניתוח כדי לחלץ פרמטרי ריכוז דיפוזיה מולקולריים מן עקומות autocorrelation שנוצרו מודגש. לסיכום, פרוטוקול בסיסי למדידות FCS מסופק; ניתן בעקבותיו ידי אימונולוגים עם הבנה של מיקרוסקופיה confocal אך ללא ניסיון קודם אחרים של טכניקות למדידת פרמטרים דינמיים, כגון שיעורי דיפוזיה מולקולרית.

Introduction

פונקציות תאים חיסוניים רבות מסתמכות על דיפוזיה אינטראקציות מולקולריות בתוך ממברנות. ממברנות ביולוגיות הם מורכבים, וישנם גורמים רבים שעשויים להיות חשובים לתפקוד של תאי מערכת החיסון יכול להשפיע על מהירות של דיפוזיה translational של חלבונים בתוך קרומים תאיים ^1. הראינו לאחרונה כי הרג טבעי (NK) תאים, לימפוציטים שייך למערכת החיסון המולדת, להפגין דיפוזיה הפרש של שני חלבונים למדו בבית קרום התא בהתאם למצב של תא NK הפעלה ^2.

מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה כי הוא מסוגל לכימות שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות ביולוגיות. זה מדווח על קצב הדיפוזיה הממוצע של fluorescently שכותרתו מולקולות בנפח קבוע, בדרך כלל מוקד מיקרוסקופ confocal. היא מבוססת על מדידת תנודות קרינה המתרחשת על תנועה מולקולרית במערכת במצב עמיד. FCS כבר בשימוש נרחב ללימוד דיפוזיה של צבעי ניאון וחלבונים, הוא פתרון ובתוך ממברנות שומנים בדם. פרמטרי פלט נוספים המשפיעים על קצב הדיפוזיה יכולים להיות גם למדו בעקיפין בדרך זו (למשל, שינויים קונפורמציה של חלבונים או אינטראקציות של מולקולות על קרום תא) ^{3, 4.} FCS בולטת לעומת טכניקות אחרות בשל הרגישות הגבוהה שלו, מה שמאפשר את האפשרות לגילוי מולקולה בודדת. זה עובד גם עבור ריכוזים מולקולריים nanomolar למגוון millimolar, אשר אופיינית עבור רמות ביטוי אנדוגני של רוב החלבונים ^5. יתר על כן, FCS יכול לתת קירוב המספר המוחלט של חלבונים בתוך הנפח למד, בעוד רוב הטכניקות אחרות רק לתת מידע ביחס על רמות ביטוי חלבון. שיטות אחרות כדי למדוד את שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות כוללים fluoהתאוששות rescence לאחר photobleaching (FRAP), חלקיק בודד מעקב (SPT), FCS חריר המרובה, ושיטות התמונה קורלציה. FRAP ושיטות תמונת מתאם טכניקות הרכב, אשר בדרך כלל לא מספקות מידע על מספרם המוחלט של מולקולות ^10. לעומת SPT, התפוקה של FCS היא גבוהה ביחס המאפיין את הממוצע באוכלוסייה. הניתוח הוא גם פחות תובעני מאז קצב הדיפוזיה הממוצע של המולקולות הנוכחות בתוך מוקד הליזר נמדד, ולא בשיעור של מולקולות בודדות. כמו כן, אלא אם כן מיקרוסקופים מיוחדים זמינים ^11, SPT לא יכול לתת שום מידע על ריכוזי, מאז תיוג SPT תקן חייב להיות נמוך מאוד על מנת לאפשר זיהוי של מולקולות בודדות. מצד השני, FCS מחייב המולקולות הנחקרת להיות ניידות. זה פשוט לא מזהה כל שברים המשוערת נייחים או מולקולות נעו לאט יותר. שיעור דיפוזיה של מולקולותמתגוררים בתוך המוקד שאורכן עולה על עשירית מהזמן הרכישה לא להיות מיוצג כראוי במדידות FCS ^{3, 12.} לכן, מקדמי דיפוזיה שרשמו FCS נוטים להיות מהיר יותר מאשר שיעורי דיפוזיה דיווחו מטכניקות כמו FRAP ו SPT, שבו קרוב ל-נייח איטית מאוד שברים נלקחים בחשבון גם כן. SPT גם ייתן תיאור מפורט יותר של ההשתנות של שיעורי דיפוזיה בתוך האוכלוסייה המולקולרית מ FCS יהיה.

FCS מכמת את התנודות של עוצמת קרינה לאורך זמן בתוך הנפח הנרגש. במקרה של מדידות קרום, זה מתרגם ל השטח המואר של הממברנה. במאמר זה, אנו מנצלים את העובדה כי תנודות כאלה הן המושרה על ידי מולקולות המפגינות דיפוזיה בראונית ובכך עוברות פנימה וחוצה של נפח העירור. ישנם גם מספר מקורות אפשריים אחרים עבור fluctuaהמשא ב האות הקרינה, כגון מהבהב או נוכחות של טריפלט ב fluorophores, השפעות סביבתיות, מחייב unbinding של ליגנד, או תנועה של קרום התא כולו. מקורות שגיאה המשוערים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי FCS כדי לפרש את התוצאות במדויק ^{12, 13.} בדרך כלל, שיעורי דיפוזיה לרוחב ממברנות ביולוגיות נמוכים בשל צפיפות ואינטראקציות, הוא בין חלבונים בממברנה ובין חלבוני שלד התא. מבחינה הסטורית, השימוש FCS בממברנות ובכך כבר הקשה על ידי חוסר fluorophores צילום יציב, אשר נדרשים כדי למנוע הלבנה בזמני המעבר המורחבים דרך התמקדות עירור ^14. עם זאת, היום, יש שפע של אפשרויות עבור צבעי צילום יציב מתאימים. שיפורים משמעותיים גלאי ורכיבי חומרה אחרת גם לאפשר זיהוי של prote הניאוןכל פרטי צבעים של בהירות נמוכה יותר. כאן, פרוטוקול בסיסי עבור היישום של FCS באמצעות לימפוציטים העיקרי בעכברים, שבו החלבון של עניין מסומן עם fluorescently מתויג נוגדן, מתואר. גישה כדי להתאים את עקומות autocorrelation כדי לחלץ את מקדם הדיפוזיה ואת הצפיפות המולקולרית מוצגת גם. הפרוטוקול שיתפשר עוקב אחריו בקלות על ידי אימונולוגים ללא ניסיון קודם של טכניקות ללמוד דיפוזיה של מולקולות. עם זאת, הבנה בסיסית של מיקרוסקופיה confocal צפויה (כדי לקבל הבנה בסיסית זו, ראה התייחסות ^15). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות יחסית לתאי השעיה אחרים, הוא שורות תאי תאים ראשוניים. עבור משתמשים מנוסים יותר FCS, שיטות ניתוח מעודנות יותר להתקיים, שחלקם מתוארים הדיון.

Protocol

1. מכתים עבור FCS לבודד תאי NK בעכברים מן לימפוציטים טחול באמצעות תיוג חרוז מגנטי, על פי הפרוטוקול של היצרן 16. השתמש 2-3 x 10 5 תאים לדגימה עבור השלבים הבאים. הערה: השתמש סלקציה שלילית להעשיר את אוכלוסיי?…

Representative Results

תוצאה אופיינית יפיק עקומת autocorrelation עם זמן המעבר בטווח של 10 מילי-שניות ל -400 מילי-שניות עבור חלבונים בממברנה. מספר מולקולות יכול להשתנות בין 0.5 ל סביב 200 לכל מיקרומטר 2 עבור חלבונים הביע באופן אנדוגני. בדוק היטב כי CPM אינו נמוך מהצפוי. המשמעות יכולה…

Discussion

פרוטוקול זה עבור FCS יכול לשמש להערכת דינאמיקה מולקולארית של מולקולות פני השטח על כל סוגי תאים חיסוניים (Murine, אדם, או מינים אחרים). אמצעי FCS במרחב ובזמן דינאמיקה מולקולארית עד רזולוצית מולקולה בודדת בתאים חיים. הצפיפות המולקולרית, וכן את דינמיקת קצב אשכולות דיפוזיה של ה…

Materials

MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	–	–	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom