प्राथमिक लिम्फोसाइटों के प्लाज्मा झिल्ली प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा में आणविक प्रसार
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) उच्च स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ जैविक झिल्लियों के भीतर अणुओं के प्रसार के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। एफसीएस कोशिका झिल्ली में fluorescently लेबल अणुओं की आणविक एकाग्रता और प्रसार गुणांक यों कर सकते हैं। इस तकनीक (वास्तविक माप समय के दौरान परिणाम को प्रभावित करने प्रक्रियाओं के बिना, यानी) स्थिर अवस्था में प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में अणुओं की आणविक प्रसार विशेषताओं का पता लगाने की क्षमता है। एफसीएस प्रोटीन है कि सबसे अंतर्जात प्रोटीन के लिए विशिष्ट स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं के प्रसार के अध्ययन के लिए उपयुक्त है। इधर, प्राथमिक लिम्फोसाइट पर कोशिका झिल्ली प्रोटीन के प्रसार की दर निर्धारित करने के लिए एक सीधा और मजबूत विधि का प्रदर्शन किया है। एंटीबॉडी से सना हुआ जीवित कोशिकाओं और अधिग्रहण के बाद आमतौर पर होने वाली टिप्पणियों पर माप प्रदर्शन करने के लिए एक प्रभावी तरीका बताया गया है। हाल ही में प्रगतिफोटो-स्थिर फ्लोरोसेंट रंगों के विकास में रुचि के एंटीबॉडी conjugating रंगों कि माप के दौरान बड़े पैमाने पर ब्लीच नहीं है उचित द्वारा उपयोग किया जा सकता है। साथ ही, इस धीरे-धीरे diffusing संस्थाओं का पता लगाने, जो कोशिका झिल्ली में व्यक्त प्रोटीन की एक आम सुविधा है के लिए अनुमति देता है। उत्पन्न autocorrelation घटता से आणविक एकाग्रता और प्रसार मानकों को निकालने के लिए विश्लेषण प्रक्रिया पर प्रकाश डाला है। सारांश में, एफसीएस मापन के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल प्रदान की जाती है; यह immunologists द्वारा confocal माइक्रोस्कोपी की समझ के साथ है, लेकिन इस तरह के आणविक प्रसार की दर के रूप में गतिशील मापदंडों को मापने के लिए तकनीक का कोई अन्य पिछले अनुभव के साथ पीछा किया जा सकता है।
Introduction
कई प्रतिरक्षा कोशिकाओं कार्यों आणविक प्रसार और झिल्ली के भीतर बातचीत पर भरोसा करते हैं। जैविक झिल्लियों जटिल हैं, और कई कारकों है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह सेलुलर झिल्ली 1 के भीतर प्रोटीन के translational प्रसार की गति को प्रभावित कर सकते हैं के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है। हमने हाल ही में पता चला है कि प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं (एन.के.), सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से संबंधित लिम्फोसाइट, एन.के. सेल सक्रियण 2 की स्थिति पर निर्भर करता है कोशिका झिल्ली में दो अध्ययन प्रोटीन का अंतर प्रसार दिखा रहे हैं।
प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) एक तकनीक है कि जैविक झिल्लियों के भीतर आणविक प्रसार की दर बढ़ाता करने में सक्षम है। यह की fluorescently एक निश्चित मात्रा में लेबल अणुओं औसत प्रसार दर, आम तौर पर एक confocal खुर्दबीन का ध्यान केंद्रित रिपोर्ट। यह प्रतिदीप्ति में उतार-चढ़ाव की माप है कि में आणविक आंदोलन पर होते हैं पर आधारित हैस्थिर अवस्था में एक प्रणाली है। एफसीएस व्यापक रूप से, फ्लोरोसेंट रंगों और प्रोटीन के प्रसार के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है दोनों समाधान में और लिपिड झिल्ली के भीतर। प्रसार दर प्रभावित करने वाले अन्य उत्पादन मानकों को भी परोक्ष रूप से इस फैशन में अध्ययन किया जा सकता है (जैसे, प्रोटीन कोशिका झिल्ली पर अणुओं की बातचीत के गठनात्मक परिवर्तन) 3, 4। एफसीएस एकल अणु का पता लगाने के लिए संभावना की अनुमति अपने उच्च संवेदनशीलता के कारण अन्य तकनीकों की तुलना में बाहर खड़ा है। यह millimolar श्रृंखला के लिए nanomolar, जो सबसे अधिक प्रोटीन 5 की अंतर्जात अभिव्यक्ति के स्तर के लिए विशिष्ट है में आणविक सांद्रता के लिए अच्छी तरह से काम करता है। इसके अलावा, एफसीएस जबकि अधिकांश अन्य तकनीकों केवल प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के बारे में जानकारी देने के रिश्तेदार, अध्ययन मात्रा के भीतर प्रोटीन की कुल संख्या का एक सन्निकटन दे सकते हैं। अन्य तरीकों आणविक प्रसार की दर को मापने के लिए झिल्ली के भीतर Fluo शामिलphotobleaching (FRAP) के बाद rescence वसूली, एक कण ट्रैकिंग (एसपीटी), कई पिनहोल एफसीएस, और छवि सहसंबंध के तरीकों। FRAP और छवि सहसंबंध के तरीकों पहनावा तकनीक है, जो आम तौर पर अणुओं 10 की पूर्ण संख्या के बारे में जानकारी नहीं देते हैं। एसपीटी की तुलना में, एफसीएस के throughput आबादी औसत निस्र्पक के संबंध में अधिक है। विश्लेषण भी कम मांग के बाद से लेजर फोकस के भीतर मौजूद अणुओं की औसत प्रसार दर मापा जाता है, न कि एकल अणुओं की दर से अधिक है। इसके अलावा, जब तक कि विशेष माइक्रोस्कोप उपलब्ध 11 हैं, एसपीटी नहीं सांद्रता के बारे में किसी भी जानकारी के बाद से मानक SPT लेबलिंग बहुत एकल अणुओं की पहचान के लिए अनुमति देने के लिए कम होना चाहिए दे सकते हैं। दूसरी ओर, एफसीएस अध्ययन के तहत अणुओं मोबाइल होने की आवश्यकता है। यह बस किसी भी ख्यात स्थिर भिन्न या बहुत धीरे धीरे आगे बढ़ अणुओं का पता नहीं लगा होगा। अणुओं के प्रसार की दर है किअधिग्रहण के समय के लगभग दसवां सही ढंग से एफसीएस माप 3, 12 में प्रतिनिधित्व नहीं दिया जाएगा की तुलना में अब फोकस के भीतर रहते हैं। इसलिए, प्रसार एफसीएस द्वारा दर्ज गुणांक FRAP और एसपीटी, जहां बंद करने वाली स्थिर और बहुत धीमी गति से भिन्न के रूप में अच्छी तरह से ध्यान में रखा जाता तरह की तकनीक से सूचना प्रसार की दर से अधिक तेजी से हो जाते हैं। एसपीटी भी की तुलना में एफसीएस होगा आणविक आबादी के भीतर प्रसार की दर की परिवर्तनशीलता के एक अधिक विस्तृत विवरण देना होगा।
एफसीएस उत्साहित मात्रा के भीतर समय पर प्रतिदीप्ति तीव्रता की अस्थिरता quantifies। झिल्ली माप के मामले में, यह झिल्ली के प्रबुद्ध क्षेत्र के लिए अनुवाद। इस पत्र में, हम तथ्य यह है कि इस तरह के उतार चढ़ाव ब्राउनियन प्रसार का प्रदर्शन करते अणुओं द्वारा प्रेरित कर रहे हैं और इस प्रकार में और उत्तेजना की मात्रा के बाहर जा रहे हैं का उपयोग। वहाँ भी fluctua के लिए कई अन्य संभावित स्रोत हैंइस तरह निमिष या fluorophores, पर्यावरण प्रभाव में एक त्रिक राज्य की उपस्थिति, बंधन-unbinding ligand, या पूरे कोशिका झिल्ली के आंदोलन के रूप में प्रतिदीप्ति संकेत में माहौल। ये ख्यात त्रुटि के सूत्रों का कहना है कि जब आदेश में सही परिणाम 12, 13 की व्याख्या करने में एक एफसीएस प्रयोग डिजाइन को ध्यान में रखा जाना चाहिए। आमतौर पर, जैविक झिल्लियों में पार्श्व प्रसार की दर भीड़ और संबंधों के कारण कम कर रहे हैं, दोनों झिल्ली प्रोटीन के बीच और प्रोटीन और cytoskeleton के बीच। ऐतिहासिक, झिल्ली में एफसीएस के उपयोग इस प्रकार फोटो स्थिर fluorophores, जो उत्तेजना फोकस 14 के माध्यम से बढ़ाया पारगमन समय के दौरान विरंजन से बचने के लिए आवश्यक हैं की कमी आड़े आती कर दिया गया है। बहरहाल, आज, वहाँ उपयुक्त तस्वीर स्थिर रंगों के लिए बहुत सारे विकल्प हैं। डिटेक्टरों और अन्य हार्डवेयर में महत्वपूर्ण सुधार भी फ्लोरोसेंट prote का पता लगाने की अनुमतिभारतीय नौसेना पोत और कम चमक के रंगों। इधर, murine प्राथमिक लिम्फोसाइट का उपयोग कर एफसीएस के आवेदन, जहां ब्याज की प्रोटीन एक fluorescently के साथ लेबल है टैग की एंटीबॉडी के लिए एक बुनियादी प्रोटोकॉल, वर्णित है। आदेश प्रसार गुणांक और आणविक घनत्व निकालने के लिए autocorrelation घटता फिट करने के लिए एक दृष्टिकोण यह भी दिखाया गया है। प्रोटोकॉल आसानी से अणुओं के प्रसार का अध्ययन करने के लिए तकनीक का कोई पूर्व अनुभव के साथ immunologists द्वारा पीछा किया जा रहा करना है। हालांकि, confocal माइक्रोस्कोपी की एक बुनियादी समझ की उम्मीद है (इस बुनियादी समझ हासिल करने के लिए, संदर्भ 15 देखें)। इस प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत आसानी से अन्य निलंबन की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता दोनों सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं। अधिक अनुभवी एफसीएस उपयोगकर्ताओं के लिए, और अधिक परिष्कृत विश्लेषण के तरीकों मौजूद हैं, जिनमें से कुछ चर्चा में वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
के लिए एफसीएस इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं (murine, मानव, या अन्य प्रजाति) के सभी प्रकार पर सतह के अणुओं की आणविक गतिशीलता के आकलन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एफसीएस उपायों स्थानिक-सामयिक जीवित को?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम जीस Confocor 3 साधन के रखरखाव के लिए और सेल माप के बारे में उपयोगी टिप्स के लिए डॉ Vladana Vukojevic, आण्विक चिकित्सा के लिए केंद्र, कारोलिंस्का Institutet धन्यवाद। इस अध्ययन Vetenskapsrådet से अनुदान (अनुदान संख्या 2012 1629), मैगनस Bergvalls stiftelse, और Stiftelsen क्लेस Groschinskys minnesfond से द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
Referências
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