蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
蛍光相関分光法（FCS）は、高い空間及び時間分解能で生体膜内の分子の拡散を研究するための強力な技術です。 FCSは、細胞膜に蛍光標識された分子の分子濃度及び拡散係数を定量化することができます。この技術は、（プロセスは実際の測定時に結果に影響を与えることなく、すなわち、）定常状態における免疫細胞の原形質膜中の分子の分子拡散特性を探索する能力を有します。 FCSは、ほとんどの内因性タンパク質のための典型的なレベルで発現されるタンパク質の拡散を研究するのに適しています。ここでは、一次リンパ球上の細胞膜タンパク質の拡散速度を決定するための簡単かつ堅牢な方法が示されています。抗体染色生細胞と買収後の一般的に存在する観測に測定を実行するための効果的な方法が記載されています。最近の進歩フォト安定した蛍光色素の開発に測定中に広範囲に漂白しない染料を適切なために目的の抗体を結合することにより利用することができます。また、これは、細胞膜に発現したタンパク質の共通の特徴である、ゆっくりと拡散するエンティティの検出を可能にします。生成された自己相関曲線から分子濃度と拡散パラメータを抽出するための分析手順が強調表示されます。要約すると、FCS測定のための基本的なプロトコルが提供されます。それは、共焦点顕微鏡の理解ではなく、このような分子の拡散速度などの動的パラメータを測定するための技術の無い他の以前の経験と免疫学者を続けることができます。
Introduction
多くの免疫細胞の機能は、分子拡散し、膜内の相互作用に依存しています。生体膜は複雑であり、免疫細胞の機能に重要であり得る多くの因子が細胞膜1内のタンパク質の並進拡散の速度に影響を与えることができます。我々は最近、自然免疫系に属するナチュラルキラー（NK）細胞、リンパ球、NK細胞活性化2の状態に応じて、細胞膜の2つの研究のタンパク質の差拡散を示すことが示されました。
蛍光相関分光法（FCS）は、生体膜内の分子の拡散速度を定量化することが可能な技術です。これは、固定されたボリューム内の蛍光標識された分子の平均拡散速度、共焦点顕微鏡の一般的に焦点を報告します。これは、中分子運動の際に発生する蛍光の変動の測定に基づいています定常状態でのシステム。 FCSは、溶液中及び脂質膜の中に両方の蛍光色素とタンパク質の拡散を研究するために広く使用されています。拡散速度に影響を与える他の出力パラメータは、また、間接的にこの方法で研究することができる（ 例えば、タンパク質または細胞膜上の分子の相互作用の立体構造変化）3、4。 FCSは、単一分子検出のための可能性を可能にする、その高い感度のために他の技術に比べて際立っています。これは、ほとんどのタンパク質5の内因性発現レベルに典型的なミリモルの範囲にナノモル、中の分子の濃度に適しています。他のほとんどの技術が唯一のタンパク質発現レベルについての相対的な情報を提供しながら、さらに、FCSは、研究ボリューム内のタンパク質の絶対数の近似値を与えることができます。膜内の分子拡散速度を測定する他の方法は、フルオが含まれます（FRAP）を光退色後のrescence回復、単一粒子追跡（SPT）は、複数のピンホールFCS、および画像相関方法。 FRAPと画像相関法は、一般の分子10の絶対数についての情報を与えていないアンサンブル技術です。 SPTと比較すると、FCSのスループットは、母集団の平均を特徴付けるの点で高くなっています。レーザー焦点内に存在する分子の平均拡散速度がなく、1つの分子の速度よりも、測定されているので分析も負担が小さいです。特殊な顕微鏡は11用意されていない限り、標準的なSPTの標識は、単一分子の同定を可能にするために非常に低くなければならないためにも、SPTは、濃度に関する情報を与えることはできません。一方、FCSは、研究中の分子がモバイルであることが必要です。それは単に非常にゆっくりと移動し、任意の推定される不動の分画または分子を検出しません。その分子の拡散速度取得時間の10分の1程度が正しくFCS測定3、12で表現されることはありませんよりも長い焦点内に存在します。したがって、FCSによって記録された拡散係数がto-不動-近く、非常に遅い画分も同様に考慮されFRAPとSPT、のような技術から報告拡散速度よりも速くなる傾向があります。 SPTはまた、FCSの意志よりも分子集団内での拡散速度の変動のより詳細な説明を行います。
FCSは興奮ボリューム内の経時的な蛍光強度の変動を定量化します。膜測定の場合には、これは、膜の照明領域に変換されます。本稿では、そのような変動はブラウン拡散を示す分子によって誘導されるため、および励起体積の外に移動しているという事実を利用しています。 fluctuaのためのいくつかの他の可能なソースもあります。このような結合バインド解除、全細胞膜のリガンド、または運動の、点滅またはフルオロフォア、環境への影響で三重項状態の存在のような蛍光シグナルのン、。これらの推定上の誤差源は、正確な結果12、13を解釈するためにFCS実験を設計する際に考慮される必要があります。一般的に、生体膜における横方向の拡散率は、膜タンパク質の間にタンパク質および細胞骨格間の両方、混雑との相互作用に起因する低いです。歴史的には、膜中のFCSを使用することは、従って、励起焦点14を貫通通過時間中に退色を避けるために必要な光安定性蛍光体の欠如によって妨げられてきました。しかし、今日、適切な光安定性染料のためのオプションがたくさんあります。検出器および他のハードウェアの大幅な改善はまた、蛍光proteの検出を可能にします低輝度のインおよび染料。ここでは、目的のタンパク質は、蛍光タグ化抗体で標識されたマウス初代リンパ球を用いたFCSの適用のための基本的な手順について説明します。拡散係数および分子密度を抽出するために自己相関曲線を適合させる手法も示されています。プロトコルは、簡単に分子の拡散を研究するための技術の以前の経験を持つ免疫学者が続くことを目指しています。しかし、共焦点顕微鏡の基本的な理解が期待されている（参照15を参照して 、この基本的な理解を得るために）。このプロトコルは、比較的容易に他の懸濁細胞、細胞株および初代細胞の両方に適合させることができます。より洗練された分析方法が存在し、より経験豊富なFCSユーザーの場合、そのうちのいくつかは、議論に記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
FCSのためのこのプロトコルは、免疫細胞（マウス、ヒト、または他の種）のすべてのタイプの表面分子の分子動力学の評価のために使用することができます。生細胞における単一分子の解像度にダウンFCS対策時空間分子動力学を。分子密度、ならびに目的のタンパク質の拡散速度とクラスタリングのダイナミクスは、自己相関曲線から抽出することができます。
蛍光標?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々はツァイスConfocor 3機器のメンテナンスのため、およびセル測定に関する役立つヒント博士Vladanaブコエビッチ、分子医学センター、カロリンスカ研究所に感謝します。この研究はVetenskapsrådet（承認番号2012- 1629年）、マグナスBergvallsのstiftelseから、とStiftelsenクレスGroschinskysのminnesfondからの助成金によって賄われていました。
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
Referências
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