Молекулярная диффузия в плазматических мембранах первичных лимфоцитах Измеренные с помощью флуоресцентной корреляционной спектроскопии
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) является мощным средством для изучения диффузии молекул в биологических мембранах с высоким пространственным и временным разрешением. FCS может количественно концентрации молекул и коэффициент диффузии флуоресцентно меченных молекул в клеточной мембране. Этот метод имеет возможность исследовать молекулярные характеристики диффузии молекул в плазматической мембране клеток иммунной системы в устойчивом состоянии (т.е. без процессов , влияющих на результат в течение фактического времени измерения). FCS пригоден для изучения диффузии белков, которые экспрессируются на уровнях, характерных для большинства эндогенных белков. Здесь, простой и надежный метод для определения скорости диффузии клеточных мембран белков на первичных лимфоцитов демонстрируется. Эффективный способ для выполнения измерений на антитела окрашенных живых клеток и часто встречающихся наблюдений после приобретения описаны. Последние достиженияв развитии фото- стабильными флуоресцентные красители могут быть использованы сопряжением интерес антител к соответствующим красители, которые не отбеливателем широко во время измерений. Кроме того, это позволяет обнаруживать медленно диффундирующих лиц, что является общим признаком белков, экспрессируемых в клеточных мембранах. Процедура анализа для извлечения параметров концентрации молекул и диффузии из генерируемых кривых автокорреляционных выделена. Таким образом, базовый протокол для измерения FCS предусмотрен; это может сопровождаться иммунологи с пониманием конфокальной микроскопии, но без другого предыдущего опыта измерений динамических параметров, таких как молекулярные скорости диффузии.
Introduction
Многие иммунные клетки функции зависят от молекулярной диффузии и взаимодействий внутри мембран. Биологические мембраны являются сложными, и многие факторы , которые могут быть важны для функционирования иммунных клеток может влиять на скорость трансляционной диффузии белков внутри клеточных мембран 1. Недавно мы показали , что естественные киллеры (NK) клетки, лимфоциты , принадлежащие к врожденной иммунной системе, обнаруживают дифференциальную диффузии двух исследуемых белков на клеточной мембране в зависимости от состояния активации NK – клеток 2.
Флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), представляет собой метод, который способен количественной оценки молекулярных скоростей диффузии в биологических мембранах. Он сообщает, средняя скорость диффузии флуоресцентно меченных молекул в фиксированном объеме, как правило, в центре внимания конфокальной микроскопии. Он основан на измерении колебаний флуоресценции, которые возникают при движении в молекулярномсистема в стационарном состоянии. FCS, широко используется для изучения диффузии флуоресцентных красителей и белков, как в растворе, и в липидных мембранах. Другие выходные параметры , влияющие на скорость диффузии может быть также косвенным образом изучены таким образом (например, конформационные изменения белков или взаимодействий молекул на клеточных мембран) 3, 4. FCS выделяется по сравнению с другими методами из-за его высокой чувствительности, что позволяет возможность для обнаружения одиночных молекул. Он хорошо работает для молекулярных концентраций в наномолярной в миллимолярной диапазоне, что характерно для эндогенных уровней экспрессии большинства белков 5. Кроме того, FCS может дать приближение абсолютного количества белков в составе исследуемого объема, в то время как большинство других методов только дают относительную информацию об уровнях экспрессии белка. Другие методы для измерения молекулярных скоростей диффузии внутри мембраны включают Fluoвосстановление ценция после фотообесцвечивания (FRAP), одночастичные слежения (СПТ), множественный обскура FCS, и корреляции изображений методы. FRAP и корреляции изображений методы ансамбля методы, которые обычно не дают информации о абсолютного числа молекул 10. По сравнению с SPT, пропускная способность FCS выше в отношении характеризующий среднюю численность населения. Анализ также менее требовательны, так как средняя скорость диффузии молекул, присутствующих в фокусе лазера измеряется, а не скорости отдельных молекул. Кроме того , если специализированные микроскопы не доступны 11, СПТ не может дать никакой информации о концентрациях, так как стандартная маркировка SPT должна быть очень низкой , чтобы для идентификации одиночных молекул. С другой стороны, ССК требует исследуемых молекул, чтобы быть мобильным. Он просто не обнаруживает каких-либо предполагаемых неподвижные фракции или молекулы движутся очень медленно. Скорость диффузии молекул,находиться в центре внимания больше , чем примерно одна десятая часть времени приобретения не будут правильно представлены в измерениях FCS 3, 12. Таким образом, коэффициенты диффузии, записанные FCS, как правило, быстрее, чем скорость диффузии сообщили из таких методов, как FRAP и СПТ, где близкие к неподвижна и очень медленные фракции принимаются во внимание, как хорошо. SPT также дать более подробное описание изменчивости скоростей диффузии в молекулярной населения, чем может FCS.
FCS квантифицирует колебания интенсивности флуоресценции с течением времени в пределах возбужденного объема. В случае мембранных измерений, это приводит к освещаемой площади мембраны. В данной работе мы используем тот факт, что такие колебания индуцированный молекулами, проявляющих броуновской диффузии и, таким образом, движется в и из объема возбуждения. Есть также несколько других возможных источников для Колебанияции в сигнале флуоресценции, такие как моргание или присутствии триплетного состояния в флуорофоров, воздействие на окружающую среду, связывающий необязывающий лиганда, или перемещение всей клеточной мембраны. Эти мнимые источники ошибок должны быть приняты во внимание при разработке эксперимента FCS для того , чтобы точно интерпретировать результаты 12, 13. Как правило, боковые скорости диффузии в биологических мембранах невелик из-за скученности и взаимодействий, как между мембранными белками и между белками и цитоскелетом. Исторически сложилось, что использование FCS в мембранах Таким образом , было затруднено из – за отсутствия фото стабильных флуорофоров, которые необходимы , чтобы избежать отбеливания во время длительного времени прохождения через фокус 14 возбуждения. Тем не менее, на сегодняшний день, существует множество вариантов подходящих фото устойчивых красителей. Значительное улучшение детекторов и другого оборудования также позволяют обнаруживать флуоресцентного защмодули и красители более низкой яркости. Здесь, основной протокол для применения FCS с использованием мышиных первичных лимфоцитов, где представляющий интерес белок, меченный флуоресцентно меченого антитела, описывается. Подход, чтобы соответствовать кривые автокорреляции для того, чтобы извлечь коэффициент диффузии и плотность молекул также показана. Протокол направлен на быть легко следуют иммунологи без предыдущего опыта методов для изучения диффузии молекул. Тем не менее, основное понимание конфокальной микроскопии , как ожидается , (чтобы получить это базовое понимание, см ссылку 15). Этот протокол может быть относительно легко адаптированы к другим суспензии клеток, как клеточные линии и первичные клетки. Для более опытных пользователей FCS, существуют более тонкие методы анализа, некоторые из которых описаны в обсуждении.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол для FCS может быть использован для оценки молекулярной динамики поверхностных молекул на всех типах клеток иммунной системы (мышиным, человеческим или других видов). FCS меры пространственно-временные молекулярной динамики с разрешением до одной молекулы в живых клетках. П…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Vladana Вукоевич, Центр молекулярной медицины, Каролинского института для поддержания Цейсс Confocor 3 прибора и полезные советы относительно измерений клеток. Это исследование было профинансировано за счет субсидий из Vetenskapsrådet (грант количество 2012- 1629), Магнус Bergvalls stiftelse, и от Stiftelsen Клаас Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
Referências
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements–photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution – a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
