Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia
Summary
A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.
Abstract
espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una poderosa técnica para el estudio de la difusión de las moléculas dentro de las membranas biológicas con una alta resolución espacial y temporal. FCS puede cuantificar el coeficiente de concentración y la difusión molecular de moléculas marcadas con fluorescencia en la membrana celular. Esta técnica tiene la capacidad de explorar las características de difusión molecular de las moléculas en la membrana plasmática de las células inmunes en el estado de equilibrio (es decir, sin procesos que afectan el resultado durante el tiempo de medición real). FCS es adecuado para el estudio de la difusión de las proteínas que se expresan en niveles típicos de proteínas más endógenas. Aquí, se demuestra un método sencillo y robusto para determinar la velocidad de difusión de las proteínas de la membrana celular en los linfocitos primarios. se describen Una manera eficaz de realizar mediciones en células vivas de anticuerpos manchados y observaciones que ocurren comúnmente después de la adquisición. Los avances recientesen el desarrollo de los tintes fluorescentes foto-estable pueden ser utilizados por la conjugación de los anticuerpos de interés de apropiarse de tintes que no usar lejía ampliamente durante las mediciones. Además, esto permite la detección de entidades que se difunden lentamente, lo que es una característica común de las proteínas expresadas en las membranas celulares. se pone de relieve el procedimiento de análisis para extraer parámetros de concentración y de difusión molecular a partir de las curvas de autocorrelación generados. En resumen, se proporciona un protocolo básico para las mediciones de FCS; que puede ser seguido por los inmunólogos con una comprensión de la microscopía confocal, pero con ninguna otra experiencia anterior de técnicas para la medición de parámetros dinámicos, tales como velocidades de difusión molecular.
Introduction
Muchas funciones células inmunes se basan en la difusión molecular y las interacciones dentro de las membranas. Las membranas biológicas son complejos, y muchos factores que pueden ser importantes para la función de las células inmunes puede influir en la velocidad de difusión de traslación de las proteínas dentro de las membranas celulares 1. Recientemente, hemos mostrado que las células asesinas naturales (NK), los linfocitos que pertenecen al sistema inmune innato, exhiben la difusión diferencial de dos proteínas estudiadas en la membrana celular en función del estado de activación de las células NK 2.
espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una técnica que es capaz de cuantificar las velocidades de difusión molecular dentro de las membranas biológicas. Se informa de la velocidad de difusión media de la etiqueta fluorescente moléculas en un volumen fijo, por lo general en el foco de un microscopio confocal. Se basa en la medición de las fluctuaciones de la fluorescencia que se producen tras el movimiento molecular enun sistema en estado estacionario. FCS ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la difusión de los tintes fluorescentes y proteínas, tanto en solución y dentro de las membranas lipídicas. Otros parámetros de salida que afectan a la velocidad de difusión también pueden ser estudiados indirectamente de esta manera (por ejemplo, los cambios conformacionales de proteínas o interacciones de las moléculas en las membranas celulares) 3, 4. FCS se destaca en comparación con otras técnicas debido a su alta sensibilidad, lo que permite la posibilidad para la detección de moléculas individuales. Funciona bien para concentraciones moleculares en el rango nanomolar a milimolar, que es típico de los niveles de expresión endógenos de la mayoría de las proteínas 5. Por otra parte, FCS puede dar una aproximación del número absoluto de proteínas dentro del volumen estudiado, mientras que la mayoría de otras técnicas sólo dan información relativa sobre los niveles de expresión de proteínas. Otros métodos para medir la velocidad de difusión molecular dentro de las membranas incluyen fluocencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), solo rastreo de partículas (SPT), múltiples estenopeica FCS, y correlación de imagen métodos. Métodos FRAP y de correlación de imágenes son técnicas por conjuntos, que por lo general no dan información sobre el número absoluto de moléculas 10. En comparación con SPT, el rendimiento de FCS es mayor en lo que se refiere a la caracterización de la media de la población. El análisis también es menos exigente, ya que se mide la velocidad de difusión media de las moléculas presentes en el foco del láser, en lugar de la velocidad de moléculas individuales. También, a menos microscopios especializados están disponibles 11, SPT puede no da ninguna información acerca de las concentraciones, ya etiquetado estándar SPT debe ser muy bajo para permitir la identificación de moléculas individuales. Por otro lado, FCS requiere las moléculas en estudio sean móviles. Simplemente no detectará ningún fracciones inmóviles putativos o moléculas que se mueven muy lentamente. La tasa de difusión de las moléculas queresidir dentro del enfoque más de aproximadamente un décimo del tiempo de adquisición no será representado correctamente en las mediciones de FCS 3, 12. Por lo tanto, los coeficientes de difusión registrados por FCS tienden a ser más rápido que las velocidades de difusión reportados a partir de técnicas como FRAP y SPT, donde se toman las fracciones cercanas al inmóvil y muy lentos en cuenta también. SPT también dará una descripción más detallada de la variabilidad de las tasas de difusión dentro de la población molecular que el FCS.
FCS cuantifica la fluctuación de la intensidad de fluorescencia con el tiempo dentro del volumen excitado. En el caso de mediciones de membrana, esto se traduce en la zona iluminada de la membrana. En este trabajo, utilizamos el hecho de que estas fluctuaciones son inducidas por las moléculas que exhiben difusión browniano y por lo tanto se están moviendo dentro y fuera del volumen de excitación. También hay varias otras fuentes posibles para la fluctuaciones en la señal de fluorescencia, tales como el parpadeo o la presencia de un estado triplete en los fluoróforos, los efectos ambientales, la unión-unbinding del ligando, o el movimiento de la totalidad de la membrana celular. Estas fuentes de error putativo hay que tener en cuenta al diseñar un experimento FCS con el fin de interpretar con precisión los resultados 12, 13. Típicamente, las tasas de difusión lateral en las membranas biológicas son bajos debido a la aglomeración y las interacciones, tanto entre proteínas de membrana y entre las proteínas y el citoesqueleto. Históricamente, el uso de FCS en las membranas de este modo se ha visto obstaculizada por la falta de fluoróforos foto-estable, que son necesarios para evitar la decoloración durante los tiempos de tránsito extiende a través del foco de excitación 14. Sin embargo, hoy en día, hay un montón de opciones para tintes foto-estable adecuados. Mejoras significativas en los detectores y otros equipos también permiten la detección de una prot fluorescenteins y tintes de menor brillo. Aquí, un protocolo básico para la aplicación de FCS utilizando linfocitos primarios murinos, donde la proteína de interés se marca con un anticuerpo marcado con fluorescencia, se describe. También se muestra un enfoque para adaptarse a las curvas de autocorrelación con el fin de extraer el coeficiente de difusión y la densidad molecular. El protocolo tiene como objetivo ser seguido fácilmente por los inmunólogos sin experiencia previa de técnicas para estudiar la difusión de las moléculas. Sin embargo, se espera que una comprensión básica de la microscopía confocal (para obtener este conocimiento básico, véase la referencia 15). Este protocolo puede relativamente fácilmente ser adaptado a otras células en suspensión, las dos líneas celulares y células primarias. Para los usuarios más experimentados FCS, existen métodos de análisis más refinados, algunos de los cuales se describen en la discusión.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo de FCS se puede utilizar para la evaluación de la dinámica molecular de moléculas de la superficie de todos los tipos de células inmunes (murino, humano, u otras especies). Medidas FCS dinámica molecular espacio-temporales abajo a la resolución de una sola molécula en las células vivas. La densidad molecular, así como la dinámica del tipo de difusión y la agrupación de las proteínas de interés, se pueden extraer de las curvas de autocorrelación.
El marcaje fluor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Vladana Vukojevic, Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska para el mantenimiento del instrumento Zeiss ConfoCor 3 y para consejos útiles con respecto a las mediciones de células. Este estudio fue financiado por becas de Vetenskapsrådet (número de concesión 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, y desde Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | – | – | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
Referências
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