Molekylär diffusion i plasmamembran primära lymfocyter Mätt genom fluorescenskorrelationsspektroskopi

Summary

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Abstract

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en kraftfull teknik för att studera diffusion av molekyler inom biologiska membran med hög spatial och temporal upplösning. FCS kan kvantifiera den molekylära koncentrationen och diffusionskoefficienten av fluorescensmärkta molekyler i cellmembranet. Denna teknik har förmågan att utforska de molekylära diffusionsegenskaper av molekyler i plasmamembranet av immunceller i stationärt tillstånd (det vill säga, utan processer som påverkar resultatet under själva mättid). FCS är lämplig för att studera diffusion av proteiner som uttrycks på nivåer som är typiska för de flesta endogena proteiner. Här är en enkel och robust metod för att bestämma diffusionshastigheten av cellmembranproteiner på primära lymfocyter påvisats. Ett effektivt sätt att utföra mätningar på antikropps färgade levande celler och vanligt förekommande observationer efter förvärvet beskrivs. De senaste framstegeni utvecklingen av fotostabila fluorescerande färgämnen kan utnyttjas genom att konjugera antikropparna av intresse till lämpliga färgämnen som inte bleka utför under mätningarna. Dessutom möjliggör detta för påvisande av långsamt diffunderande enheter, vilket är en vanlig egenskap hos proteiner som uttrycks i cellmembran. Förfarandet analys för att extrahera koncentrations- och spridningsparametrar molekyl från de genererade autokorrelationskurvorna är markerat. Sammanfattningsvis är en grundläggande protokollet för FCS mätningar tillhandahålls, det kan följas av immunologer med en förståelse för konfokalmikroskopi men med någon annan tidigare erfarenhet av metoder för att mäta dynamiska parametrar, såsom molekylär diffusion priser.

Introduction

Många immunceller funktioner är beroende av molekylär diffusion och interaktioner inom membran. Biologiska membran är komplexa, och många faktorer som kan vara viktiga för funktionen av immunceller kan påverka hastigheten på translationell diffusion av proteiner inom cellulära membran ^1. Vi visade nyligen att naturliga mördarceller (NK), lymfocyter som tillhör det medfödda immunförsvaret, uppvisar differentiell diffusion av två studerade proteiner på cellmembranet beroende på tillståndet hos NK-cellsaktivering ^2.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en teknik som är i stånd att kvantifiera molekylär diffusion priser inom biologiska membran. Den rapporterar den genomsnittliga diffusionshastigheten för fluorescensmärkt molekyler i en fixerad volym, typiskt i fokus för ett konfokalt mikroskop. Den är baserad på mätning av fluktuationer i fluorescens som uppstår på molekylär rörelse iett system i stabilt tillstånd. FCS har använts i stor utsträckning för att studera spridningen av fluorescerande färgämnen och proteiner, både i lösning och i lipidmembran. Andra utgångsparametrar som påverkar diffusionshastigheten kan också indirekt studeras på detta sätt (t.ex., konformationsändringar i proteiner eller interaktioner av molekyler på cellmembran) ^{3, 4.} FCS står ut i förhållande till andra tekniker på grund av dess höga känslighet, vilket gör att möjligheten till enda molekyl detektering. Det fungerar bra för molekylära koncentrationer i nanomolar till millimolar intervall, vilket är typiskt för endogena expressionsnivåer av de flesta proteiner ^5. Dessutom kan FCS ge en approximation av det absoluta antalet proteiner i den studerade volymen, medan de flesta andra tekniker ger endast relativ information om proteinuttrycksnivåer. Andra metoder för att mäta molekylär diffusion priser inom membran innefattar fluometoder rescence återhämtning efter fotoblekning (FRAP), enda partikel spårning (SPT), flertal hål FCS och bildkorrelations. FRAP och bildkorrelationsmetoder är ensembletekniker, som i allmänhet inte ger information om det absoluta antalet molekyler ^10. Jämfört med SPT, är genomströmningen av FCS högre i fråga om karakterisering av befolkningsgenomsnittet. Analysen är också mindre krävande eftersom den genomsnittliga diffusionshastigheten för de molekyler som är närvarande i den laserfokus mäts, snarare än graden av enskilda molekyler. Dessutom, om inte särskilda mikroskop finns ^11, SPT kan inte ge någon information om koncentrationer, eftersom standard SPT märkningen måste vara mycket låg för att möjliggöra identifiering av enskilda molekyler. Å andra sidan, kräver FCS de molekyler under studie för att vara mobila. Det kommer helt enkelt inte upptäcka några förmodade orörliga fraktioner eller molekyler som rör sig mycket långsamt. Diffusionshastigheten för molekyler somuppehålla sig inom fokus längre än ungefär en tiondel av förvärvstiden inte vara korrekt representerade i FCS mätningar ^{3, 12.} Därför diffusionskoefficienter registrerats av FCS tenderar att vara snabbare än diffusion som rapporterats från tekniker som FRAP och SPT, där nära till orörliga och mycket långsamma fraktioner beaktas också. SPT kommer också att ge en mer detaljerad beskrivning av variationen i diffusionshastigheter inom molekylär befolkningen än FCS kommer.

FCS kvantifierar fluktuationer i fluorescensintensiteten över tiden inom upphetsad volym. I fallet med membran mätningar, översätter detta till det belysta området av membranet. I detta dokument använder vi det faktum att sådana variationer induceras av molekyler som uppvisar Brownsk diffusion och därmed flyttar in och ut ur exciteringsvolymen. Det finns också flera andra möjliga källor för fluctuationer i fluorescenssignalen, såsom blinkande eller närvaron av en triplett tillstånd i fluoroforer, miljöeffekter, bindnings ej bindande av liganden, eller förflyttning av hela cellmembranet. Dessa förmodade felkällor måste beaktas när man utformar en FCS experiment för att korrekt tolka resultaten ^{12, 13.} Typiskt, lateral diffusion priser i biologiska membran är låga på grund av trängsel och interaktioner, både mellan membranproteiner och mellan proteiner och cytoskelettet. Historiskt sett har användningen av FCS i membran därmed hämmats av brist på fotostabila fluoroforer, som krävs för att undvika blekning under de förlängda transittider genom excitation fokus ^14. Men i dag, det finns gott om alternativ för lämpliga fotostabila färgämnen. Betydande förbättringar i detektorer och annan hårdvara gör det också möjligt att upptäcka fluorescerande proteins och färgämnen med lägre ljusstyrka. Här, en grundläggande protokollet för tillämpning av FCS med användning av murina primära lymfocyter, där proteinet av intresse är märkt med en fluorescensmärkta antikroppen, beskrivs. Ett tillvägagångssätt för att passa autokorrelationskurvor för att extrahera diffusionskoefficienten och molekyldensiteten visas också. Protokollet syftar till att lätt följt av immunologer med ingen tidigare erfarenhet av tekniker för att studera spridningen av molekyler. Emellertid är en grundläggande förståelse för konfokalmikroskopi förväntas (för att få denna grundläggande förståelse, se referens ^15). Detta protokoll kan relativt lätt anpassas till andra suspensionsceller, både cellinjer och primära celler. För mer erfarna FCS användare, finns mer förfinade analysmetoder, av vilka några beskrivs i diskussionen.

Protocol

1. Färgning för FCS Isolera murina NK-celler från mjältlymfocyter med hjälp av magnetisk pärla märkning, enligt tillverkarens protokoll 16. Använd 2-3 x 10 5 celler per prov för följande steg. Anmärkning Använd negativ selektion för att berika målcellspopulationen och lämnar den orörd, så att cellerna kan märkas med användning av primära antikroppar enbart. Se mer detaljerad information om cellisolering från möss 2 referen…

Representative Results

Ett typiskt resultat kommer att generera en autokorrelationskurva med en genomgångstid i intervallet 10 ms till 400 ms för membranproteiner. Antalet molekyler kan variera mellan 0,5 till omkring 200 per | j, m 2 för endogent uttryckta proteiner. Kontrollera noga att CPM inte är lägre än väntat. Detta kan innebära att det finns en påverkan av bakgrundssignalen. Som en tumregel bör CPM signalen på celler som accepteras för analys inte vara lägre än 33% av CPM för …

Discussion

Detta protokoll för FCS kan användas för bedömningen av de molekylära dynamiken i ytmolekyler på alla typer av immunceller (murin, human eller andra arter). FCS mäter spatio-temporala molekyldynamik ner till enda molekyl upplösning i levande celler. Den molekylära densitet, liksom diffusionshastigheten och klusterdynamik av proteinerna av intresse, kan extraheras från autokorrelationskurvor.

Den fluorescerande märkningen är av central betydelse för framgångsrika FCS experiment….

Materials

MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	–	–	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/s 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/s 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom