Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK-cel cytotoxiciteit is een veel gebruikte maat voor het effect van externe interventie NK celfunctie bepalen. Echter, de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van deze test onstabiel beschouwd, hetzij door een vergissing gebruiker of vanwege de gevoeligheid van NK cellen voor experimentele manipulatie. Om deze problemen te elimineren, een workflow die hen reduceert tot een minimum werd opgericht en wordt hier gepresenteerd. Ter illustratie, we bloedmonsters op verschillende tijdstippen van lopers (n = 4), die een intensieve training opgemeten werden. Eerst worden NK-cellen tegelijkertijd geïdentificeerd en geïsoleerd door middel van CD56-tagging en magnetische gebaseerde sortering direct uit volbloed en van slechts één milliliter. De gesorteerde NK cellen verwijderd van elke reagens of capping antilichamen. Ze kunnen worden geteld om een nauwkeurige NK cellen vast per milliliter bloed. Ten tweede kan de gesorteerd NK-cellen (effector cellen of E) worden gemengd met 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO) hebben K562 cellen (doelcellen of T) en een test-optimaal 1: 5 T: E-verhouding en geanalyseerd met een beeldvormende flow cytometer dat zorgt voor de visualisatie van elk voorval en het verdwijnen van een valspositieve of valse negatieven (zoals doubletten of effectorcellen). Deze workflow kan worden voltooid in ongeveer 4 uur, en zorgt voor een zeer stabiele resultaten, zelfs bij het werken met menselijke monsters. Indien beschikbaar, kunnen onderzoeksteams testen verschillende experimentele interventies bij menselijke proefpersonen, en vergelijk metingen tussen verschillende tijdstippen, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van de gegevens.
Introduction
Natural killer cellen zijn een essentieel onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Terwijl de kamers worden gereguleerd, ze hebben de mogelijkheid om te herkennen en te elimineren abnormale cellen via cel-cel contact en zonder voorafgaande activering 1. Als zodanig vormen ze een snelle lijn van verdediging tegen infecties. Oefening, intense, is aangetoond dat tijdelijk onderdrukken van het immuunsysteem 2, 3, 4, 5. NK-cellen zijn bijzonder gevoelig voor dit effect 4, 6, 7, waardoor effectief een venster van verhoogde gevoeligheid voor ziekte. Vandaar dat de studie van interventies voor, tijdens of na intensieve training met als doel het verminderen van de gevolgen NK celfunctie van bijzonder belang is voor het welzijn van atleten na wedstrijden.
<p class= "jove_content"> Echter, de studie van dergelijke ingrepen bemoeilijkt door verschillende factoren: 1) NK-cellen zijn schaars 8 bij ongeveer 1% van de witte bloedcellen compartiment; 2) NK-cellen zeer gevoelig zijn voor stress en vertrouwen op constante blootstelling aan fysiologische omstandigheden levensvatbaar en stabiel tijdens experimenten te blijven; en 3) standaard assays voor NK-cel cytotoxiciteit te bepalen, zoals Ficoll gradiënten 9 kort assays 10, onbetrouwbaar en inconsistent. De inherente variabiliteit van menselijke stalen verbinding alleen deze kwesties. Verse menselijke monsters verzameld tijdens ingrepen zijn vrij geregeld en moeilijk te schaffen, tenminste in vergelijking met diermonsters of geïmmortaliseerde cellijnen. Dit vermindert de kansen om experimenten te herhalen of de deelnemers aan de studie cohort om significante statistische drempels bereiken. Tezamen zijn deze problemen achter de noodzaak voor een gestroomlijnde protocol waarmee for zowel high-throughput en een zeer betrouwbare analyse van de NK-cel lytische activiteit in menselijke monsters.We hebben een workflow dat de tijd verkort die nodig zijn om te identificeren, te isoleren en te testen NK-cellen uit menselijk bloed terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan externe factoren. De werkwijze optimaliseert het gebruik van twee instrumenten, een magnetisch gebaseerde celsorteerinrichting en een beeldvormende stromingscytometer en een test-specifieke, geoptimaliseerde T: E verhouding tot de detectie van afname of toename van NK-cel cytotoxiciteit mogelijk.
Protocol
Representative Results
Discussion
De werkwijze beschreven in deze studie meet direct de specifieke activiteit van NK-cellen van een individu in reactie op stimuli (in dit geval, langdurige oefening). Kenmerkend worden NK-cellen geïsoleerd van bloed dichtheidsscheiding gradiënten of celsortering door een combinatie van merkers. Hoewel deze werkwijzen op grote schaal worden gebruikt, hebben veel nadelen: ze zijn tijdrovend, omvatten meerdere manipulaties en zijn sterk afhankelijk van de gebruiker. Hierdoor wordt onnodige nadruk gelegd op de geïsoleerde…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
Referências
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. . Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , (2001).
