인간의 전체 혈액 자연 살해 세포 용 균성 활동의 유세포 분석
Summary
This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.
Abstract
NK 세포는 NK 세포 독성 세포 기능에 대한 외부 간섭의 영향을 결정하기 위해 널리 사용되는 척도이다. 그러나,이 분석의 정확성 및 재현성 때문에 사용자의 오류로 인해 또는 실험 조작에 NK 세포의 감도 역시 불안정한 것으로 간주 될 수있다. 이러한 문제를 제거하기 위해 최소로 줄여 워크 플로우에 설립되었으며 여기에 표시됩니다. 우리는 선수에서, 다양한 시점에서 혈액 샘플을 얻어 설명하기 위해 (N = 4) 운동의 강렬한 한판 승부에 제출 된 그. 첫째, NK 세포를 동시에 확인하고 직접 전체 혈액에서와 같은 작은 하나 밀리리터에서, CD56 태그 및 자기 기반의 정렬을 통해입니다. 정렬 된 NK 세포는 시약 또는 상한 항체의 제거됩니다. 이들은 혈액 밀리리터 정확한 NK 세포 수를 설정하기 위해 계산 될 수있다. 둘째, 분류 NK 세포 (이펙터 세포 또는 E)를 3,3'- Diotade와 혼합 될 수있다각 이벤트의 시각화 및 위양성의 제거를 허용하는 촬상 유동 세포 계측기를 사용하여 E 비율 분석 : 5 T : cyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)은 분석 최적 1의 K562 세포 (표적 세포 또는 T)를 태그 또는 (예 : 이중선 또는 이펙터 세포와 같은) 위음성. 이 워크 플로는 약 4 시간에 완료, 심지어 인간의 샘플 작업을 매우 안정적인 결과를 허용 할 수 있습니다. 가능한 경우, 연구 팀은 인체에서 여러 가지 실험적인 개입을 테스트, 데이터의 무결성을 손상시키지 않고 여러 시점에 걸쳐 측정을 비교할 수 있습니다.
Introduction
자연 살해 세포는 선천성 면역계의 필수 요소이다. 그들은 매우 조절 동안, 인식하고 세포 간 접촉을 통해 사전 활성화 일없이 비정상 세포를 제거하는 기능을 갖는다. 따라서, 그들은 감염에 대한 방어의 빠른 라인을 형성한다. 특히 심한 운동은, 일시적으로 면역 시스템 2, 3, 4, 5를 누르는 것으로 나타났다. NK 세포가 효과적으로 질병 향상된 감도의 창을 생성이 효과 4, 6, 7, 특히 쉽다. 따라서, 개입의 연구는 전, 중 또는 NK 세포 기능에 미치는 영향을 줄이는 목적으로 강렬한 운동 후하는 운동 선수 후 대회의 복지에 대한 특별한 관심입니다.
<p class= "jove_content"> 그러나, 이러한 개입의 연구는 다양한 요인에 의해 복잡하게된다 : NK 세포는 백혈구 실의 약 1 %에서 8 드물다 1); 2) NK 세포 스트레스에 매우 민감하고 실험 기간 동안 생존하고 안정적으로 유지하는 생리 학적 조건에 노출에 의존하는 상수; 3) 표준 분석은 피콜 구배 9로, NK 세포의 세포 독성을 확인하고 분석 (10)를 해제, 신뢰할 수와 일치하지 않습니다. 인간 샘플의 고유 한 변화는 이들 이슈 인 화합물. 중재 동안에 수집 된 신선한 인간 샘플 적어도 동물 샘플 또는 불멸화 세포주에 비해, 수배 상당히 규제하고 어렵다. 이 실험을 반복하거나 통계적으로 유의 임계 값에 도달하기 위해 연구 코호트에 참가자를 추가 할 수있는 기회를 감소시킨다. 종합적으로, 이러한 문제는 fo를 간소화 할 수있는 프로토콜의 필요성을 지원R 모두 높은 처리량과 인간 시료에서 NK 세포 용균 활성의 높은 신뢰도 분석.우리는 식별 외부 인자에 대한 노출을 최소화하면서 인간의 전혈로부터 분리하고 시험 NK 세포에 필요한 시간을 단축 워크 플로우를 구축. 감소 또는 NK 세포의 세포 독성의 증가를 검출 할 수 있도록 E 비율 : 상기 방법은 두 기기, 자기 기반의 셀 소터와 사이토 촬상 흐름 및 분석 특정 최적화 T의 사용을 최적화한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구에 기재된 방법은 직접 (특히이 경우, 장시간 운동) 자극에 응답하여 개인의 NK 세포의 특이 적 활성을 측정한다. 일반적으로, NK 세포는 마커의 조합을 사용하여 분류 밀도 구배 또는 셀을 사용하여 하나의 혈액으로부터 분리된다. 그들은 시간이 걸리는 다수의 조작을 수반 한 사용자 심하게 의존하는 이러한 방법이 널리 사용되지만, 그들은 여러 단점을 가지고있다. 그 결과, 과도한 스트?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant no. 2100-68003-30395 from the USDA National Institute of Food and Agriculture.
Materials
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
Referências
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