Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

Jennifer E. McBride; Mary P. Meaney; Casey John; David C. Nieman; Renaud F. Warin

doi:10.3791/54779

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Artigo de método

Citometria de fluxo e assassinas naturais celular Lytic Actividade em sangue total humano

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DOI:

10.3791/54779

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17 de março de 2017

Jennifer E. McBride¹ , Mary P. Meaney² , Casey John² , David C. Nieman² , Renaud F. Warin¹

¹Center for Excellence in Post-Harvest Technologies, North Carolina A&T State University, North Carolina Research Campus, ²Human Performance Laboratory, Appalachian State University, North Carolina Research Campus

Neste artigo

Resumo

Este trabalho descreve um fluxo de trabalho avançado para a determinação precisa e rápida da contagem de células NK (Natural Killer) e citotoxicidade de células NK em amostras de sangue humano.

Resumo

a citotoxicidade das células NK é uma medida utilizada para determinar o efeito de uma intervenção externa sobre a função da célula NK. No entanto, a precisão e reprodutibilidade deste ensaio pode ser considerado instável, quer devido a erros do utilizador ou por causa da sensibilidade das células NK para manipulação experimental. Para eliminar estes problemas, um fluxo de trabalho que eles se reduz a um mínimo foi estabelecida e é apresentada aqui. Para ilustrar, obtivemos amostras de sangue, em vários momentos, desde corredores (n = 4), que foram submetidos a uma intensa sessão de exercício. Primeiro, as células NK são simultaneamente identificados e isolados através de marcação de CD56 e de triagem magnética baseada, directamente a partir de sangue inteiro e de tão pouco como um mililitro. As células NK são ordenados removido de quaisquer anticorpos de reagentes ou de nivelamento. Eles podem ser contados, a fim de estabelecer uma contagem de células NK precisa por mililitro de sangue. Em segundo lugar, as células NK (células efectoras ordenados ou E) pode ser misturado com 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) marcaram células K562 (células alvo ou T) a um ensaio-óptima de 1: 5 razão T: E, e analisadas usando um imaging fluxo-citómetro que permite a visualização de cada evento e a eliminação de qualquer falsa positiva ou falsos negativos (como doublets ou células efetoras). Este fluxo de trabalho pode ser completada em cerca de 4 h, e permite a resultados muito estáveis mesmo quando se trabalha com amostras humanas. Quando disponíveis, as equipes de pesquisa pode testar várias intervenções experimentais em seres humanos, e comparar as medidas em toda a vários pontos de tempo, sem comprometer a integridade dos dados.

Introdução

células assassinas naturais são um elemento essencial do sistema imune inato. Embora eles são muito regulado, eles têm a capacidade de reconhecer e eliminar células anormais através de contacto célula-a-célula e sem activação prévia ^1. Como tal, eles formam uma linha rápida de defesa contra as infecções. O exercício, especialmente intensa, tem sido demonstrado para deprimir o sistema imunitário de forma transiente ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^5. As células NK são particularmente propensos para este efeito ^{^4,....}