São necessários novos métodos de isolamento de células endoteliais primárias de vasos sanguíneos. Este protocolo descreve uma nova técnica que inverte completamente os vasos sanguíneos de interesse, expondo apenas o lado endotelial à digestão enzimática. A cultura de células endoteliais puras resultante pode ser usada para estudar doenças cardiovasculares, modelagem de doenças e angiogênese.
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Artigo de método
Isolamento e cultura de células endoteliais primárias de Artérias e Veias canina
Neste artigo
Resumo
Resumo
A doença cardiovascular é estudada na medicina humana e veterinária. As células endoteliais têm sido amplamente utilizadas como modelo in vitro para estudar vasculogênese, angiogênese (tumoral) e aterosclerose. O padrão atual para pesquisa in vitro em células endoteliais humanas (CEs) é o uso de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e células endoteliais da artéria umbilical humana (HUAECs). Para a pesquisa endotelial canina, apenas uma linha celular (CnAOEC) está disponível, que é derivada do endotélio aórtico canino. Embora atualmente não seja completamente compreendido, há uma diferença entre CEs originados de artérias ou veias. Para uma abordagem mais direta dos estudos de funcionalidade in vitro em CEs, descrevemos um novo método para isolar células endoteliais primárias caninas (CaPECs) de uma variedade de vasos. Essa técnica reduz a chance de contaminação com células de crescimento rápido, como fibroblastos e células musculares lisas, um problema comum em métodos de isolamento padrão, como lavar o vaso com soluções enzimáticas ou picar o vaso antes da digestão do tecido que contém todas as células. A técnica que descrevemos foi otimizada para o modelo canino, mas pode ser facilmente utilizada em outras espécies, como a humana.
Introdução
Cães são usados como modelo animal grande para a pesquisa da doença cardiovascular e também podem sofrer de anormalidades vasculares (genéticas) inatos 1, 2. Para estudar estas doenças linhas de células endoteliais comerciais são muitas vezes utilizados para avaliar a funcionalidade das células endoteliais (CE). Para os cães que há uma linha de células endoteliais comercial disponível (CnAOEC), derivadas da aorta canino. Esta linha celular é usado principalmente em estudos como controlo normal ECs 3-5. Na pesquisa cardiovascular humano as linhas de células endoteliais mais utilizados são células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) e um....
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Protocolo
Ética declaração: Os vasos sanguíneos utilizados neste estudo foram colhidas como material excedente obtido a partir de cadáveres caninos frescos (n = 4) a partir de cães saudáveis sacrificados para outras pesquisas independentes (a política Universidade 3R). vasos sanguíneos anormais (desvios portossistêmicos intra e extra-hepáticos, n = 1 cada) foram colhidas post-mortem após consentimento informado dos proprietários de cães apresentados com a Clínica Universitária de Animais de Companhia da Universidade de Utrecht.
1. Isolamento e Cultura de pilhas Canine endoteliais
- Pré-revestir placas de 6 cavidades com 2 ml / poço de 0,....
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Resultados
Vasos sanguíneos diferentes foram submetidas com sucesso para o protocolo de isolamento descrito (Figura 2). Foi possível dissecar e inverter aorta, veia cava, veia porta e artéria coronária em cães saudáveis (todos os vasos de cada cão, n = 4). Com os mesmos ECs abordagem foram isolados a partir de dois desvios portossistêmicos congênitos (extra-hepáticas e intra-hepática, n = 1 cada). Embora aorta foi facilmente invertida, segmentos da aorta torácica foram mais desaf.......
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Discussão
Em estudos com foco em ECs canino a linha primária CnAOEC é usado para modelar as linhagens endoteliais do cão 3, 12, 13. Em estudos humanos, a cultura HUVEC ainda é considerada o padrão-ouro. Claramente, concentrando-se apenas em ECs derivadas do cordão umbilical é uma restrição firme na investigação cardiovascular. As células endoteliais têm um padrão de expressão de genes específicos de determinar especificação arteriovenosa. A fim de levar em conta essas diferenças nos vasos pós-natal apresentamos este mé.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a Hans de Graaf e Tomas Veenendaal por sua assistência técnica na cultura dos CEs.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Colagenase tipo II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1x) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Solução Salina Balanceada | Life Technologies | 14025-050 | |
| Meio de Crescimento de Células Endoteliais Caninas | Aplicações Celulares | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Aplicações Celulares | Cn304-05 | |
| Soro Fetal de Bezerro (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| Kit de síntese iScript | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR verde super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Meio de Congelamento de Células de Recuperação | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Mantenha no gelo antes de usar |
| Recipiente de congelamento, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Tesoura cirúrgica (Mayo ou Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Pinça de mosquito | B. Braun Medical | FB440R | |
| Pinça de mosquito curva | B. Braun Medical | FB441R | |
| poliglactina 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Azul de tripano | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Câmara de contagem automatizada | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Lâminas de contagem, câmara dupla | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Descongelar lentamente no gelo |
| µ-Slide Angiogênese | Ibidi | 81501 | |
| Meio de Crescimento Endotelial | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 Kit SingleQuot | Lonza | CC-4176 |
Referências
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J.
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Reimpressões e permissões
