Isolement et culture de cellules endothéliales primaires de Artères Canine et Veins

Summary

Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.

Abstract

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.

Introduction

Les chiens sont utilisés comme modèle animal grande pour la recherche sur les maladies cardiovasculaires et peuvent également souffrir de innés (génétiques) anomalies vasculaires ^{1, 2.} Pour étudier ces maladies des lignées de cellules endothéliales commerciales sont souvent utilisés pour évaluer des cellules endothéliales (CE) fonctionnalité. Pour les chiens il y a une ligne de cellules endothéliales commerciale disponible (CnAOEC), dérivé de l'aorte canine. Cette lignée cellulaire est surtout utilisé dans les études comme témoin normal CEs ^3-5. Dans la recherche cardiovasculaire humain lignes de cellules endotheliales les plus couramment utilisées sont des cellules humaines endothéliales de veine ombilicale (HUVEC) et ombilicale humaine Artère cellules endothéliales (HUAEC) provenant de la veine du cordon ombilical humain et de l'artère, respectivement. HUVEC ont été utilisés comme la norme d' or dans la recherche vasculaire depuis les années 1980 ^6. Ils sont considérés comme le système de modèle classique pour étudier la fonction endothéliale et de l'adaptation de la maladie. Les cellules endothéliales isolées à partir de différents vaisseaux sanguins varient en appearance et la fonctionnalité en raison de fond génétique et l' exposition au microenvironnement ^7. En outre, HUVEC et HUAEC sont dérivées du cordon ombilical, une structure vasculaire de développement qui pourraient ne pas pleinement imiter les vaisseaux sanguins des adultes par rapport aux conditions qu'ils sont exposés à et de la réponse à la maladie. Par conséquent, la traduction des résultats trouvés dans HUVEC et HUAEC aux maladies cardiovasculaires en général est insuffisant.

Lorsque l'on étudie l'adaptation et le comportement des adultes CEs, CEs primaires du navire d'intérêt devrait être utilisé comme une approche plus directe. Pour isoler ces cellules, plusieurs procédés ont été rapportés. Un procédé largement décrit, qui est également utilisé pour HUVEC, est le rinçage de la cuve avec une solution de digestion enzymatique ^8. Il en résulte souvent une contamination par des non telles que les cellules endothéliales et les fibroblastes ⁹ musculaires lisses. Une autre méthode fréquemment utilisée pour l'isolement est la digestion enzymatique du tissu de vaisseau émincé suivie par fluorescencetri des cellules activées (FACS) en fonction endothéliale Cluster marqueur de cellules de différenciation (CD) , 31 ^{7, 8.} tri FACS et la culture cellulaire ultérieure exige des quantités relativement importantes de cellules et ne convient donc pas pour l'isolement de l' endothélium des petits vaisseaux sanguins. Nous avons donc cherché à mettre au point une nouvelle méthode robuste pour isoler une population de cellules endothéliales pur à partir de divers vaisseaux sanguins canine avec une grande pureté. Pour tester l'efficacité de la nouvelle méthode d'isolement, nous avons isolé et obtenu Canine endothéliale primaire cellulaire (CAPEC) des cultures pures de différentes artères et les veines canines, grandes et petites. Ce procédé permet également la culture des cellules endothéliales provenant de malades et / ou des vaisseaux aberrants tels que des shunts portosystémiques intra ou extra-hépatiques congénitaux, une maladie courante chez les chiens ^2. Le procédé permet l'isolement de types cellulaires appropriés supplémentaires du même navire, tels que des cellules musculaires lisses vasculaires, puisque la majeure partie du bateau reste intagir au cours de la procédure.

Protocol

Éthique déclaration: Les vaisseaux sanguins utilisés dans cette étude ont été récoltées en tant que matériau de surplus obtenu à partir de cadavres frais canins (n ​​= 4) des chiens en bonne santé euthanasiés pour d'autres recherches sans rapport (politique de l'Université 3R). vaisseaux sanguins aberrants (shunts portosystémiques intra- et extrahépatiques, n = 1 chacun) ont été récoltées post-mortem après le consentement éclairé des propriétaires de chiens présentés à la clinique u…

Representative Results

Les vaisseaux sanguins différents ont été soumis avec succès au protocole d'isolement décrit (figure 2). Il était possible de disséquer et inverser l'aorte, la veine cave, la veine porte et l'artère coronaire des chiens en bonne santé (tous les navires de chaque chien, n = 4). Avec les mêmes CEs d'approche ont été isolés à partir de deux shunts portosystémiques congénitales (extrahépatique et intrahépatique, n = 1 chacun). Bien que l&#39…

Discussion

Dans les études portant sur canine CEs la ligne primaire CnAOEC est utilisé pour modéliser les lignées endothéliales du chien ^{3, 12, 13.} Dans les études humaines, la culture HUVEC est toujours considéré comme l'étalon-or. De toute évidence, en se concentrant uniquement sur CEs dérivées du cordon ombilical est une restriction ferme dans la recherche cardiovasculaire. Les cellules endothéliales ont un profil d'expression génique spécifique déterminant la spécification artérioveineuse. …

Materials

Collagenase type II	Life Technologies	17101-015
Dispase	Life Technologies	17105-041
DMEM (1X) + GlutaMAX	Life Technologies	31966-021
Hank's Balanced Salt Solution	Life Technologies	14025-050
Canine Endothelial Cells Growth Medium	Cell Applications	Cn211-500
CnAOECs	Cell Applications	Cn304-05
Fetal Calf Serum (FCS)	GE Healthcare	16000-044
TrypLE Express	Life Technologies	12604-013
SPR	Bio-Rad	170-8898
iScript synthesis kit	Bio-Rad	170-8891
SYBR green super mix	Bio-Rad	170-8886
Recovery Cell Freezing Medium	Gibco/Life Technologies	12648-010	Keep on ice prior to use
Freezing container, Nalgene Mr. Frosty	Sigma-Aldrich	C1562
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890
Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum)	B. Braun Medical	BC555R
Mosquito forceps	B. Braun Medical	FB440R
Mosquito forceps curved	B. Braun Medical	FB441R
polyglactin 3-0	Ethicon	VCP311H
Trypan blue	Bio-Rad	145-0013
Automated counting chamber	Bio-Rad	145-0102
Counting Slides, Dual Chamber	Bio-Rad	145-0011
Matrigel	BD Biosciences	BD356231	Slowly thaw on ice
µ-Slide Angiogenesis	Ibidi	81501
Endothelial Growth Medium	Lonza	CC-3156
EGM-2 SingleQuot Kit	Lonza	CC-4176