בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
כלבים משמשים כמודל חיה גדול למחקר מחלות לב וכלי דם וכן עלול לסבול מולדת (גנטי) מומים בכלי דם 1, 2. כדי לחקור מחלות אלה שורות תאים מסחריות אנדותל משמשות לעתים קרובות כדי להעריך תא האנדותל פונקציונלי (EC). לכלבים יש קו תא האנדותל מסחרי אחד זמין (CnAOEC), נגזר האאורטה כלבים. שורת תאים זה משמשת בעיקר במחקרים כשליטה נורמלית ECS 3-5. במחקר לב וכלי דם אדם שורות תאי אנדותל הנפוץ ביותר הם אדם טבורי הווריד לתאי אנדותל (HUVECs) ותאי האנדותל עורקים אדם טבורים (HUAECs) נגזרים ורידים ועורקים כבל אדם טבור, בהתאמה. HUVECs שמש כתקן זהב במחקר וסקולרית מאז 1980 6. הם נחשבים מערכת המודל הקלסית ללמוד תפקוד האנדותל והתאמת מחלה. תאי האנדותל מבודדים כלי דם שונים להשתנות appearancדואר ופונקציונליות בשל רקע גנטי וחשיפה במיקרו-סביבה של 7. בנוסף, HUVECs ו HUAECs נגזרות חבל הטבור, מבנה כלי הדם התפתחותי שעלול לא לחקות באופן מלא כלי דם בוגרים ביחס לתנאי הם נחשפים ותגובה למחלות. לפיכך, תרגום תוצאות שנמצאו HUVECs ו HUAECs למחלות לב וכלי דם בכלל אינו מספק.
כאשר לומד הסתגלות והתנהגות של ECS המבוגרת, ECS העיקרי מהספינה של ריבית צריך לשמש גישה ישירה יותר. כדי לבודד תאים אלה, מספר שיטות דווחו. שיטה שתואר נרחב, אשר משמש גם HUVECs, מוחקת את הספינה עם פתרון עיכול אנזימטי 8. זה לעתים קרובות תוצאות זיהום עם הלא-ECS כגון תאי שריר חלק פיברובלסטים 9. שיטה נוספת בשימוש תדיר לבידוד היא עיכול אנזימטי של רקמת כלי הטחונה ואחריו fluorescence-תא מיון מופעל (FACS) מבוסס על אשכול סמן תא האנדותל של בידול (CD) 31 7, 8. FACS מיון תרבית תאים עוקבות דורש כמויות גדולות יחסית של תאים, ולכן הוא לא מתאים הבידוד של האנדותל מכלי דם קטנים. לפיכך, אנו שמטרתה לפתח שיטה חזקה חדשה לבידוד אוכלוסיית תא האנדותל טהורה מכלי דם כלבים שונים עם טוהר גבוה. כדי לבדוק את יעילות שיטת הבידוד החדשה, אנחנו מבודדים וקבלנו תא האנדותל הראשי כלב טהור (CaPEC) תרבויות מן עורקי כלבים שונים ורידים, גדולים וקטנים כאחד. שיטה זו גם מאפשרת התרבות של תאי אנדותל שמקורם חולה ו / או כלי סוטה כגון shunts portosystemic תוך או חוץ-כבדית מולד, מחלה נפוצה אצל כלבים 2. השיטה מאפשרת הבידוד של תאים מסוגים רלוונטיים נוספים של אותו הכלי כמו תאי שריר חלק בכלי דם מאחר שרוב הכולים נשאר intלפעול במהלך ההליך.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקרי ההתמקדות כלבית ECS הקו העיקרי CnAOEC משמש מודל השושלות האנדותל של הכלב 3, 12, 13. במחקרים בבני אדם, תרבות HUVEC עדיין נחשבה תקן הזהב. ברור, התמקדות רק על ECS נגזרה חבל טבור היא הגבלת משרד במחקר לב וכלי דם. יש לתאי אנדותל דפוס ביטוי גנים ספציפיים קביעת מפרט arteriovenous. על מנ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
Referências
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
