Isolering och odling av primära endotelceller från Canine artärer och vener
Summary
Novel isolation methods of primary endothelial cells from blood vessels are needed. This protocol describes a new technique that completely inverts blood vessels of interest, exposing only the endothelial side to enzymatic digestion. The resulting pure endothelial cell culture can be used to study cardiovascular diseases, disease modelling, and angiogenesis.
Abstract
Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study vasculogenesis, (tumor) angiogenesis, and atherosclerosis. The current standard for in vitro research on human endothelial cells (ECs) is the use of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) and Human Umbilical Artery Endothelial Cells (HUAECs). For canine endothelial research, only one cell line (CnAOEC) is available, which is derived from canine aortic endothelium. Although currently not completely understood, there is a difference between ECs originating from either arteries or veins. For a more direct approach to in vitro functionality studies on ECs, we describe a new method for isolating Canine Primary Endothelial Cells (CaPECs) from a variety of vessels. This technique reduces the chance of contamination with fast-growing cells such as fibroblasts and smooth muscle cells, a problem that is common in standard isolation methods such as flushing the vessel with enzymatic solutions or mincing the vessel prior to digestion of the tissue containing all cells. The technique we describe was optimized for the canine model, but can easily be utilized in other species such as human.
Introduction
Hundar används som stora djurmodell för kardiovaskulär forskning sjukdom och kan också drabbas av medfödda (genetiska) kärlmissbildningar 1, 2. För att studera dessa sjukdomar kommersiella endotelceller cellinjer ofta används för att bedöma endotelceller (EG) funktionalitet. För hundar finns en kommersiell endotelceller linje finns (CnAOEC), som härrör från hund aorta. Denna cellinje används oftast i studier som kontroll normal EC 3-5. I human kardiovaskulär forskning de vanligaste endotelceller cellinjer är Human navelvenendotelceller (HUVEC) och humana navelartär endotelceller (HUAECs) härrörande från human navelsträng ven och artär, respektive. HUVEC har använts som den gyllene standarden i vaskulär forskning sedan 1980-talet 6. De anses vara det klassiska modellsystem för att studera endotelfunktion och sjukdom anpassning. Endotelceller som isolerats från olika blodkärl varierar i appearance och funktionalitet på grund av genetisk bakgrund och exponering för mikro 7. Dessutom, HUVEC och HUAECs härrör från navelsträngen, en utvecklings vaskulär struktur som kanske inte helt härma vuxna blodkärl med avseende på de villkor som de utsätts för och svar på sjukdom. Därför översätta träffar i HUVEC och HUAECs till hjärt-kärlsjukdom i allmänhet är otillräcklig.
När man studerar anpassning och beteende vuxen EC, bör primära EC från kärlet av intresse användas som ett mer direkt tillvägagångssätt. Att isolera dessa celler, har flera metoder rapporterats. En allmänt beskrivna metoden, som också används för HUVEC-celler, är spolning av kärlet med en enzymatisk digestion lösning 8. Detta resulterar ofta i kontaminering med icke-EC såsom glatta muskelceller och fibroblaster 9. En annan ofta använd metod för isolering är enzymatisk nedbrytning av malet fartyg vävnad följt av fluorescence-aktiverad cellsortering (FACS) baserat på endotelial cellmarkör Kluster av Differentiation (CD) 31 7, 8. FACS sortering och efterföljande cellodling kräver relativt stora mängder av celler och är därför inte lämplig för isolering av endotel från små blodkärl. Vi har därför inriktat på att utveckla en ny robust metod för att isolera en ren endotelceller befolkningen från olika hund blodkärl med hög renhet. För att testa effektiviteten hos den nya isoleringsmetoden, vi isolerat och fått rena Canine Primary Endothelial Cell (CaPEC) kulturer från olika hund artärer och vener, både stora och små. Denna metod möjliggör också kultur av endotelceller som härrör från sjuka och / eller avvikande fartyg såsom medfödda inträ- eller extra-lever portosystemic shuntar, en vanlig sjukdom hos hundar 2. Metoden gör det möjligt isolering av ytterligare relevanta celltyper av samma fartyg såsom vaskulära glatta muskelceller eftersom de flesta av fartyget förblir intagera under förfarandet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I studier som fokuserar på hund EC den CnAOEC primära linjen används för att modellera endotelceller linjer av hunden 3, 12, 13. I humanstudier är HUVEC kulturen fortfarande vara den gyllene standarden. Tydligt fokus enbart på EC som härrör från navelsträngen är en fast begränsning i kardiovaskulär forskning. Endotelceller har ett specifikt genuttryck mönster bestämma arteriovenös specifikation. För att ta hänsyn till dessa skillnader i postnatal fartyg presenterar vi denna nya isoleringsmet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Hans de Graaf and Tomas Veenendaal for their technical assistance in culturing the ECs.
Materials
| Collagenase type II | Life Technologies | 17101-015 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| DMEM (1X) + GlutaMAX | Life Technologies | 31966-021 | |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025-050 | |
| Canine Endothelial Cells Growth Medium | Cell Applications | Cn211-500 | |
| CnAOECs | Cell Applications | Cn304-05 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | GE Healthcare | 16000-044 | |
| TrypLE Express | Life Technologies | 12604-013 | |
| SPR | Bio-Rad | 170-8898 | |
| iScript synthesis kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
| SYBR green super mix | Bio-Rad | 170-8886 | |
| Recovery Cell Freezing Medium | Gibco/Life Technologies | 12648-010 | Keep on ice prior to use |
| Freezing container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Surgical scissors (Mayo or Metzenbaum) | B. Braun Medical | BC555R | |
| Mosquito forceps | B. Braun Medical | FB440R | |
| Mosquito forceps curved | B. Braun Medical | FB441R | |
| polyglactin 3-0 | Ethicon | VCP311H | |
| Trypan blue | Bio-Rad | 145-0013 | |
| Automated counting chamber | Bio-Rad | 145-0102 | |
| Counting Slides, Dual Chamber | Bio-Rad | 145-0011 | |
| Matrigel | BD Biosciences | BD356231 | Slowly thaw on ice |
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | 81501 | |
| Endothelial Growth Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EGM-2 SingleQuot Kit | Lonza | CC-4176 |
Referências
- Haidara, M. A., Assiri, A. S., Yassin, H. Z., Ammar, H. I., Obradovic, M. M., Isenovic, E. R. Heart Failure Models: Traditional and Novel Therapy. Curr. Vasc. Pharmacol. 13 (5), 658-669 (2015).
- van Steenbeek, F. G., van den Bossche, L., Leegwater, P. A., Rothuizen, J. Inherited liver shunts in dogs elucidate pathways regulating embryonic development and clinical disorders of the portal vein. Mamm. Genome. 23 (1-2), 76-84 (2012).
- Murai, A., Asa, S. A., Kodama, A., Hirata, A., Yanai, T., Sakai, H. Constitutive phosphorylation of the mTORC2/Akt/4E-BP1 pathway in newly derived canine hemangiosarcoma cell lines. BMC Vet. Res. 8 (1), 128 (2012).
- Boilson, B. A., et al. Regulation of circulating progenitor cells in left ventricular dysfunction. Circ. Heart Fail. 3 (5), 635-642 (2010).
- Gonzalez-Miguel, J., Morchon, R., Siles-Lucas, M., Simon, F. Fibrinolysis and proliferative endarteritis: two related processes in chronic infections? The model of the blood-borne pathogen Dirofilaria immitis. PLoS One. 10 (4), e0124445 (2015).
- Sacks, T., Moldow, C. F., Craddock, P. R., Bowers, T. K., Jacob, H. S. Oxygen radicals mediate endothelial cell damage by complement-stimulated granulocytes. An in vitro model of immune vascular damage. J. Clin. Invest. 61 (5), 1161-1167 (1978).
- Aranguren, X. L., et al. Unraveling a novel transcription factor code determining the human arterial-specific endothelial cell signature. Blood. 122 (24), 3982-3992 (2013).
- van Balkom, B. W., et al. Endothelial cells require miR-214 to secrete exosomes that suppress senescence and induce angiogenesis in human and mouse endothelial cells. Blood. 121 (19), 3997-4006 (2013).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). J. Vis. Exp. (3), e183 (2007).
- Bustin, S. A., et al. MIQE precis: Practical implementation of minimum standard guidelines for fluorescence-based quantitative real-time PCR experiments. BMC Mol. Biol. 11, 74 (2010).
- Brinkhof, B., Spee, B., Rothuizen, J., Penning, L. C. Development and evaluation of canine reference genes for accurate quantification of gene expression. Anal. Biochem. 356 (1), 36-43 (2006).
- Heishima, K., et al. MicroRNA-214 and MicroRNA-126 Are Potential Biomarkers for Malignant Endothelial Proliferative Diseases. Int. J. Mol. Sci. 16 (10), 25377-25391 (2015).
- Liu, M. M., Flanagan, T. C., Lu, C. C., French, A. T., Argyle, D. J., Corcoran, B. M. Culture and characterisation of canine mitral valve interstitial and endothelial cells. Vet. J. 204 (1), 32-39 (2015).
- van den Bossche, L., van Steenbeek, F. G. Canine congenital portosystemic shunts: disconnections dissected. The Veterinary Journal. 211, 14-20 (2015).
- Sobczynska-Rak, A., Polkowska, I., Silmanowicz, P. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) levels in the blood serum of dogs with malignant neoplasms of the oral cavity. Acta Vet. Hung. 62 (3), 362-371 (2014).
- Zhang, Q., et al. In vitro and in vivo study of hydralazine, a potential anti-angiogenic agent. Eur. J. Pharmacol. 779, 138-146 (2016).
