Dette manuskriptet beskriver hvordan å screene for thermostabilizing mutasjoner, rense den menneskelige serotonin transporter, generere høy affinitet antistoffer, og krystallisere serotonin transporter-antistoff kompleks bundet til antidepressive medikament S -citalopram. Denne protokollen kan tilpasses til studiet av andre utfordrende membran transportører, reseptorer og kanaler.
Serotonintransportøren er en natrium og klorid-coupled transporter som "pumper" ekstracellulært serotonin inn i celler. S -citalopram er et stoff som brukes til å behandle depresjon og angst ved binding til serotonin transporter med høy affinitet, blokkerer serotonin reuptake. Her rapporterer vi en effektiv prosedyre og et sett med verktøy for å stabilisere, uttrykke, renser, og krystalliserer serotonin transporter-antistoffkomplekser bundet til S -citalopram og andre antidepressiva. Mutasjoner som stabiliserer serotonintransportøren ble identifisert ved hjelp av pt S -citalopram bindingsbestemmelse. Serotonin transporter uttrykt i baculovirus-omsatte HEK293S GnTI – celler, ble rekonstruert i proteoliposomes og brukes til å heve høy affinitet antistoffer. Vi har utviklet en strategi for å oppdage antistoffer som er nyttige for strukturstudier. En grei tilnærming for uttrykket av antistoff-fragmenter i Sf9 celler er også etablert.Transporter-antistoffkomplekser renset ved hjelp av denne prosedyren er veloppdragen og lett krystalliserer, produsere komplekser med S -citalopram at diffract røntgen til 3-4 en løsning. Strategiene utvikles her kan anvendes for å bestemme strukturen til andre utfordrende membranproteiner.
Den serotonin transporter (Sert) er en integrert membranprotein som forenkler transport av serotonin over mobilnettet membraner 1. Sert tilhører en familie av Nevrotransmitter Sodium Symporters (NIH) som også omfatter dopamin og noradrenalin transportører 2. Sert er den molekylære målet for vidt foreskrevet antidepressiva og angstdempende medikamenter som virker å kompetitivt hemme serotonin transport tre. Sert utnytter energisk gunstig cotransport av natrium for å fjerne nevrotransmitter fra den synaptiske spalten. Omfattende karakterisering av serotonerge systemet har vist at endringer i serotonin metabolisme synes å påvirke nesten alle nevrologiske prosesser, inkludert humør, søvn, smerte, kognisjon og aggresjon atferd fire. Sert funksjonen kan endres gjennom bruk av antidepressiva og selektive serotoninreopptakshemmere (SSRI) som S -citalopram, samt av psychostimulants og vanedannende legemidler som amfetamin og 3,4-metylendioksy- N -methylamphetamine eller "ecstasy" 1,2.
SSRI er uhyre viktig for behandlingen av stemningslidelser, men den eksakte strukturelle basis for deres virkning er ikke godt forstått. WT Sert er ustabil i vaskemiddel miceller, og dermed hindrer utvikling mot en tredimensjonal (3D) struktur av Sert 5,6. Nylig har vi utviklet varianter av SERT som er robust stabile i et bredt spekter av vaskemidler og bibeholder SSRI bindingsaktivitet 6. Disse termostabile Sert varianter ble valgt ved hjelp av en scintillation nærhet basert termo analysen. Her beskriver vi en prosedyre for generering av høy affinitet antistoffer som kan binde Sert, og rensing og krystallisering av termostabile Sert, i kompleks med antistoff og S -citalopram.
Denne protokollen forutsetter at Sert og 8B6 gener har vært vellykkety klonet i BacMam 7 og insekt ekspresjonsvektorer, respektivt. For å generere antistoffer, ble cDNA som koder for residuer 73-616 av WT SERT klonet inn i vektoren BacMam med en C-terminal Strep-tag II (Sert IC). For termo skjermen, ble Sert rester 73-616 med C-terminal GFP, Strep II, og 10-Hans tags (Sert TC) som brukes. Individuelle punktmutasjoner ble generert i Sert TC bakgrunnen. For krystallisering protokollen ble Sert-GFP fusjonsprotein brukes med Twin-strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] og 10-Hans tags, bærer de termo mutanter, Y110A, I291A, og T439S og mutasjoner av overflate cysteiner C554A, C580A og C622A (Sert CC). Trombinspaltning sekvenser (LVPRGS) ble også satt inn i den SERT CC etter Q76 og T618 for å tillate fjerning av N- og C-termini. Plasmidet koder for 8B6 Fab ble konstruert for å uttrykke både de tunge og lettekjeder av antistoffet med GP67 sekresjons-sekvenser under kontroll av to atskilte promotorer polyhedrin. Den C-terminale enden av den tunge kjeden av 8B6-antistoff ble merket med en 8-His-tag og en trombin-spaltningssete ble satt inn mellom den tunge kjede og den koden.
Fastsettelse av membranproteinstruktur ved biofysiske teknikker fortsatt en skremmende oppgave for mange medisinsk betydelige transportører, reseptorer, og kanaler 11. Her deler vi detaljert kunnskap utviklet for strukturbestemmelse av den menneskelige serotonin transporter bundet til S -citalopram. Vi forventer at disse metodene vil være nyttig for å bestemme strukturer av Sert i andre konforme stater samt strukturer i andre vanskelige membran proteiner. Videre kan de biokjemiske teknikker som beskrives her også brukes til å studere funksjonen av renset SERT i vaskemiddel og en tilnærmet opprinnelig lipid miljø.
Sert krystallisering hengslet på utviklingen av flere verktøy og teknikker. Først forbedringer i transporter termo produsert Sert varianter som var veloppdragne i ulike vaskemiddel miceller etter ekstraksjon av transporter fra membraner 6. For det andre, brukav høyaffinitets-ligand S -citalopram hele rensing og krystallisering ytterligere forbedret stabilitet og redusert conformational heterogenitet. For det tredje, utvikling av BacMam ekspresjonssystemet 7 åpnet for produksjon av store mengder SERT i en kort periode på 2 uker, fasiliterer både immunisering og krystallisering. Til slutt, til utvikling av strategier selektere for høy-affinitets antistoffer som gjenkjenner epitoper 3D tillatt for oppdagelsen av 8B6-antistoffet som fremmer velordnet pakking av SERT-antistoffkomplekser til krystaller.
Det finnes en rekke kritiske trinn og reagenser, så vel som vanlige problemer som ofte forekommer i løpet av protokollen. For det første kan generering av høy titer SERT P2 virus være problematisk. Legge til lave konsentrasjoner av P1 virus å generere P2 virus som beskrevet i denne protokollen begrenser vanligvis dette problemet, og i tilfeller der P2 virustiter er lav, kan P3 virus gjøres using virus ved en MOI på 0,0001. Virus med en titer mindre enn 1 x 10 8 viruspartikler / ml bør ikke brukes, og vil nesten alltid resultere i lave utbytter protein. For uttrykk, HEK293S GnTI – celler ble valgt fordi de mangler N -acetylglucosaminyltransferase Jeg aktivitet og dermed kan ikke syntetisere komplekse N -glycans, i stedet produserer bare høy mannose N -glycans. EndoH kløyver N -bundne glykosylering av høye mannose glykaner på to steder i ekstracellulære sløyfe 2 (EL2), forlater en N -acetylglucosamine knyttet til asparagin. Fordøyelse av N -bundne sukker reduserer overflate entropien av EL2 som sannsynligvis viktig for krystallisering. For generering av antistoffer, må SERT IC bli brukt for immunisering. GFP er sterkt immunogent 12 og bør ikke brukes som en fusjon signal for å generere antistoffer, siden det er vanskelig å fjerne ved SEC. Den fleksible N- og C-terminalen av Sert var heller ikkesom inngår i konstruksjonen, for å unngå antistoffer mot disse regionene. Mus kan immuniseres med 30 ug rekonstituerte protein; fortsette immuniserer mus inntil høye serumkonsentrasjoner av antistoffer kan påvises og fremstille hybridomceller, som beskrevet 13. En thermostabilized konstruksjon er vanligvis det beste valget for immunisering; hvis transporter er veloppdragen og beholder biologisk aktivitet etter rensing, er dette ofte tilstrekkelig til å danne antistoffer. Den 8B6 antistoff ble reist mot WT Sert. For krystallisering, bør bare toppfraksjonene fra SEC som inneholder monodisperse komplisert som bedømmes av FSEC kombineres og konsentrert. Sert-8B6 krystaller vokser i et smalt spekter av tilstander, og det finnes en rekke tiltak som bør iverksettes for å feilsøke problemer spesielt knyttet til Sert krystallvekst. Tris-base justert med HCl bør ikke brukes i reservoaret løsning, da denne bufferen tillater ikke krystallvekst; det er derfor critiske til stedet bruke Tris justert med NaOH. SERT krystaller vokse i et smalt konsentrasjonsområde av PEG 400, slik at hvis krystaller ikke vokse eller hvis mange små krystaller viser seg, vil selv en liten økning eller minskning i PEG 400-konsentrasjonen være oppmerksom på. Videre kan additivet 6-aminoheksansyre ble også brukt i den optimerte skjermen for å forbedre kjernedannelse. Dråpen Forholdet mellom protein: vel løsningen er også en viktig avgjørende faktor for krystallvekst. Drop forholdstall på 1,5 til 2: 1 er anbefalt, med drop forholdstall nærmere 2: en typisk støtte veksten av større tre-dimensjonale krystaller. Endelig er bruken av lav profil 24-brønners plater også avgjørende mot krystallvekst, sannsynligvis på grunn av endring av hastigheten av dampdiffusjon.
En alternativ tilnærming til SPA-metoden har blitt utviklet for å skjerm for mutanter som stabiliserer rotte serotonintransportøren i en kokain-bundet konformasjon ved bruk av filterbindingsbestemmelse 5. I motsetning SPA-based-analyse gjør det mulig for sekvensielle oppvarmingstrinn etter ved bestemmelse av den fraksjon av SERT som forblir bundet til ligand. Således gir mulighet for den raske bestemmelse av smeltetemperaturen fra et lite antall prøver. SPA-metoden er avhengig av tilgjengeligheten av en radiomerket ligand med høy affinitet og hvis ingen ligander er kjent som binder med submicromolar affinitet deretter en annen løsning vil være nødvendig. Mange andre fremgangsmåter blir ofte brukt til å måle proteinstabilitet, for eksempel binding av fluorescerende fargestoffer og kalorimetri 14 men er lav gjennomstrømming og er enten ikke i stand til direkte å måle funksjon eller kreve store mengder protein. Hvis ikke kan anvendes SPA-metoden, er en alternativ high-throughput tilnærming en FSEC-baserte termostabilitet Assay 15 (FSEC-TS), hvor prøven blir oppvarmet etterfulgt av separering av den fraksjon av gjenværende transporter. FSEC-TS er en nyttig tilnærming for å få tilgang kromatografisk oppførsel og oligomere staten og er apowerful komplementærverktøy som kan brukes sammen med SPA-metoden.
En sammenligning av ulike felles protein uttrykk systemer ble også funnet å favorisere bruk av pattedyrceller for Sert uttrykk 16 og rask dette er trolig tilfelle for mange proteiner av opphav hos pattedyr. Metodene som vi har brukt for uttrykket er skreddersydd for Sert men sannsynligvis lett tilpasses. Betingelser som favoriserer høye nivåer av ekspresjon bør være nøye identifiseres ved å variere tidspunktet for ekspresjon, temperatur, viruskonsentrasjon, og nærværet av histondeacetylase inhibitorer slik som natriumbutyrat.
Vi vanligvis favorisere affinitetsrensing i en mild langkjedet vaskemiddel som C12M sammen med CHS før rekonstituering for å beholde høy affinitet ligandbinding. Rekonstituering ved hjelp av hydrofob absorpsjon er en mild teknikk som vi har funnet å være effektive for flere andre transportører og reseptorer. Hvis detteer ikke vellykket, fjerning av vaskemidler med høye kritiske micelle konsentrasjon av dialyse, fortynning, eller SEC kan være ansatt 17 forutsatt at antigenet er tilstrekkelig stabilt i slike vaskemidler. I tilfeller der det ikke egnede antistoffer er funnet, vi nesten alltid finne problemet skyldes tap av funksjon eller denaturering av antigen og i slike tilfeller vi vellykket utført nye vaksinasjoner betalende spesiell oppmerksomhet til protein biokjemi. Til slutt bør ligander og antistoffer som binder med høy affinitet danne grunnlag for et rasjonelt planlagt krystallisering eksperiment og ved å ta fordel av en termostabil variant, kan man screene et bredere spekter av tilstander ved å variere egenskapene til forskjellige vaskemidler. Videre krystallisering i et lipid mesofase 18 eller ved hjelp av bicelles 19 bør alltid betraktes som et alternativ til krystallisering i miceller.
Disse prinsippene og metoder kan brukes med noen modifikation for mange andre transmembranproteiner som er vanskelig å uttrykke og rense fra andre ekspresjonsverter, og vil være spesielt nyttig for strukturbestemmelse av mål med høy affinitet legemidler.
The authors have nothing to disclose.
We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.
DH10Bac | Invitrogen | 10361-012 | |
Kanamycin | Fisher | BP906-5 | |
Gentamicin | Fisher | BP918-1 | |
Tetracycline | Sigma | T-7660 | |
Bluo-gal | Invitrogen | 15519-028 | 5-Bromo-3-indolyl β-D-galactopyranoside |
IPTG | Anatrace | I1003 | |
Miniprep kit | Qiagen | 27106 | |
Cellfectin II | Invitrogen | 10362-100 | Sf9 transfection reagent |
SF9 | ATCC | CRL-1711 | |
Sf-900 III SFM media | Life Technologies | 12658-027 | |
HEK-293S GnTI- | ATCC | CRL-3022 | |
Freestyle 293 media | Life Technologies | 12338-018 | 293 expression media |
Fetal bovine serum | Life Technologies | 0984018DJ | |
Sodium butyrate | Sigma | 303410 | |
S-citalopram | Sigma | E4786 | Anagrade |
n-Dodecyl-?-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | |
Cholesteryl hemmisuccinate | Sigma | C6013 | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757P | |
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol | Avanti Polar Lipids | 840457P | |
Leupeptin | Sigma | L2884 | |
Pepstatin A | Sigma | P5318 | |
Aprotinin | Sigma | A1153 | |
PMSF | Sigma | P7626 | |
Desthiobiotin | Iba Life Sciences | 2-1000-05 | |
Asolectin | Sigma | 11145 | |
Cholesterol | Sigma | C-8667 | |
Lipid A | Sigma | L5399 | |
Brain polar lipid | Avanti Polar Lipids | 141101C | |
Biobeads | Biorad | 152-3920 | Hydrophobic absorption resin |
Goat anti-mouse IRDye 680RD | Odyssey | 926-68070 | Used as secondary for western blotting |
Lauryl maltose neopentyl glycol | Anatrace | NG310 | Anagrade |
Serotonin | Sigma | H9523 | |
pFastBac 8B6 | Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT Strep II | SERTIC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His | SERTTC, Available from authors | ||
pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His | SERTCC, Available from authors | ||
Imidazole | Sigma | 56749 | |
n-Octyl β-D-maltoside | Anatrace | O310 | Anagrade |
Thrombin | Haematologic Technologies | HCT-0020 | |
EndoH | New England Biolabs | P0702 | |
Trizma-HCl | Sigma | T5941 | Tris used for preparation of crystallization reservoirs |
PEG 400 | Sigma | 91893 | |
6-aminohexanoic acid | Sigma | 7260 | |
Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CV | |
Isoplate-96 TC | PerkinElmer | 6005070 | |
PolyJet | SignaGen | SL100688 | Polymer transfection reagent for mamalian cells |
Copper HIS-Tag YSI SPA Beads | PerkinElmer | RPNQ0096 | His-tag affinity SPA beads |
Citalopram, [N-Methyl-3H] | PerkinElmer | NET1039250UC | |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000023 | heating block for thermostability assay |
ThermoTop | Eppendorf | 5308000003 | |
SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates | Eppendorf | 5306000006 | |
0.2 µm syringe filter | Olympus Plastics | 25-243 | |
1 L filter system | Corning | 430517 | |
2 L flat bottom tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000 | |
2 L baffled tissue culture flask | Genemate | F-5909-2000B | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | 3950 | |
Forma Orbital Shaker | Thermo Scientific | 416 | |
Strep-Tactin resin | Iba Life Sciences | 2-1208-025 | Strep affinity resin |
Extruder | Northern Lipids | ||
Li-Cor imaging system | Odyssey | western blot imaging system | |
XK16 column | GE Healthcare | 28-9889-37 | column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton |
100 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC910096 | |
30 kDa MWCO protein concentrator | Millipore | UFC903024 | |
Äkta FPLC | GE Healthcare | UPC-900 | |
HPLC | Shimadzu | 51476 | |
Superose 6 (10/300) column | GE Healthcare | 17-5172-01 | Used for FSEC |
Tangential flow apparatus | Pall Filtron | ||
0.2 µm filter tangential flow cell | Pall Filtron | PSM20C11 | |
30 kDa MWCO tangential flow concentrator | Pall Filtron | OS030T12 | |
Talon resin | Clonetech | 635504 | His-tag affinity resin used for Fab purification |
1 ml HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | Cation exchanger used for Fab purification |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare | 17-5175-01 | Used for SEC separation of SERT-8B6 |
24-well VDXm plate | Hampton Research | HR3-306 | |
18 mm coverslips | Hampton Research | HR3-239 | |
Virocyt virus counter | Virocyt | 2100 | |
MicroBeta Trilux | PerkinElmer | 1450 | 96-well scintillation counter |
HiTrap SP column | GE Healthcare | 17115101 | |
Sertraline | Sigma | S6319 |