Preparazione delle colture gliali miste primarie da adulti mouse spinale tessuto del midollo
Summary
Lo sviluppo del dolore neuropatico comporta alterazioni patologiche delle cellule gliali cordone spinale. Un affidabile sistema di coltura gliali derivate da tessuto del midollo spinale adulto e progettato per studiare queste cellule in vitro è carente. Pertanto, mostriamo qui come stabilire colture gliali miste primarie di topo adulto tessuto del midollo spinale.
Abstract
È stato ben accettato che midollo spinale risposte gliali contribuiscono significativamente allo sviluppo del dolore neuropatico. Informazioni enorme per quanto riguarda attività gliali a livello cellulare e molecolare è stata ottenuta attraverso sistemi di colture cellulari in vitro. I sistemi in vitro utilizzati, includono principalmente glia primarie derivate da tessuto corticale cerebrale neonatale e immortalati linee cellulari. Tuttavia, questi sistemi potrebbero non riflettere le caratteristiche delle cellule gliali cordone spinale in vivo. Per studiare ulteriormente il ruolo delle cellule del cavo gliali spinale nello sviluppo del nervo periferico dolore neuropatico lesione indotta utilizzando un sistema di coltura che riflette meglio la condizione in vivo, il nostro laboratorio ha sviluppato un metodo per stabilire primaria del midollo spinale culture gliali miste da topi adulti. In breve, il midollo spinale si raccolti da topi adulti e trattati tramite digestione papaina seguita dalla rimozione mielina con tanelità-pendenza media. Sospensioni cellulari singoli sono coltivate in mezzi di Eagle modificato di Dulbecco completa (cDMEM) supplementato con 2-mercaptoetanolo (2-ME) a 35,9 ° C. Queste condizioni di coltura sono state ottimizzate specificamente per la crescita delle cellule gliali miste. In queste condizioni, le cellule sono pronte per essere utilizzati per la sperimentazione tra 12 – 14 d (cellule di solito sono in fase di log durante questo tempo) dopo la creazione della coltura (D 0) e possono essere tenuti in condizioni di coltura fino a D 21. Questo sistema di coltura può essere usato per studiare le risposte delle cellule gliali cordone spinale dopo stimolazione con varie sostanze e agenti. Inoltre dolore neuropatico, questo sistema può essere usato per studiare le risposte gliali in altre malattie che coinvolgono alterazioni patologiche di cellule gliali cordone spinale.
Introduction
Il dolore cronico è un grave problema di salute che colpisce circa 100 milioni di adulti negli Stati Uniti, con un costo annuo stimato di un massimo di $ 635.000.000.000 1. Prove di montaggio ha indicato un contributo significativo di cellule gliali cordone spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, uno dei più devastanti tipi di dolore cronico 2. Una corretta vitro sistema di coltura de aiuterebbe in maniera significativa nelle indagini ulteriormente i ruoli delle cellule gliali a livello cellulare e molecolare.
Attualmente, le vitro gliali sistemi di coltura utilizzati dai ricercatori includono cellule gliali principalmente derivate da tessuti corticali di topo o ratto cervelli neonatali e immortalati linee di cellule gliali derivate da topo neonatale o ratto cellule gliali primarie. cellule neonatali contengono un numero significativo di cellule indifferenziate che possono essere ulteriormente differenziate in cellule gliali (soprattutto astrociti e microglia), fornendo così uncellule bundant per l'utilizzo sperimentale 3. Tuttavia, il nostro studio precedente ha dimostrato che il cervello neonatale cellule gliali hanno risposto significativamente diverso dalle cellule gliali cordone spinale adulto su lipopolisaccaride (LPS) stimolazione. Ad esempio, l'interleuchina (IL) -4 visualizzata migliorata effetti inibitori sulla ossido nitrico LPS-indotta (NO) la produzione nel ratto adulto midollo spinale glia rispetto al neonatale cervello glia 4. Inoltre, i profili di produzione di chemochine su di stimolazione da parte di un neuropeptide, la calcitonina peptide correlato al gene (CGRP), sono indiscutibilmente differenti tra topo neonatale glia cervello (metodi descritti in Rif. 5) e di topo adulto midollo spinale glia (Figura 1). Linee cellulari stabilizzate sono facili da usare e mantenere e possono fornire un gran numero di cellule in un breve periodo di tempo. In generale, immortalate linee cellulari vengono generati sia utilizzando un sistema immortalizzazione virus-mediata (ad esempio la linea di cellule microgliali diffuso BV2) 6, 7 o dopo the l'identificazione di trasformazione spontanea (come la linea cellulare astrociti C8-D1A e la linea di cellule microgliali C8-B4) 8, 9 linee cellulari sono eccellenti in studio delle caratteristiche molecolari di astrociti e microglia individualmente.; tuttavia, i risultati ottenuti da linee cellulari richiedono sempre ulteriore validazione in cellule primarie o in condizioni in vivo. Va inoltre notato che non c'è stata una relazione di una linea cellulare gliale derivato da un roditore glia del midollo spinale.
Per aiutare indagare il ruolo delle cellule cavo gliali spinale nello sviluppo del dolore neuropatico, un sistema di coltura derivato dal topo adulto midollo spinale è stato sviluppato adattando un metodo precedentemente segnalato utilizzato per generare ratto adulto colture gliali miste 4, 5 . La cultura gliale midollo spinale di topo è stata ulteriormente raffinata recente 10 ed è descritta in dettaglio in questo articolo. Adulti midollo spinale mescolato culture gliali cun essere stabilita con un mouse da ceppi selezionati che si adattano alle esigenze di un particolare studio, e le cellule possono essere mantenute in coltura per un massimo di 21 D postare l'inizio della cultura. Questo metodo può essere usato in studi di dolore neuropatico, nonché in ricerche di varie malattie neurologiche che comportano cambiamenti patologici all'interno del midollo spinale, come la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), virus dell'immunodeficienza umana (HIV) -associated neuropatia sensoriale, e multipla La sclerosi (MS).
Protocol
Representative Results
Discussion
È fondamentale per eseguire tutte le operazioni, tra cui il supporto cambiando pianificazione in modo coerente per ottenere risultati riproducibili tra esperimenti. I seguenti passaggi sono particolarmente critico per ottenere un'eccellente qualità adulta glia misto.
La digestione enzimatica è un aspetto importante di questo protocollo. E 'fondamentale che i pezzi di tessuto sono ben digeriti in modo da ottenere una sospensione di cellule singole. Tuttavia, over-digestione comport…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
Referências
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