Preparação de culturas mista glial primários de rato adulto Spinal Cord Tissue

Summary

O desenvolvimento de dor neuropática envolve alterações patológicas das células gliais medula espinhal. Um sistema de cultura de células gliais de confiança derivados de tecidos de medula espinal adulta e concebido para estudar estas células in vitro é inexistente. Portanto, vamos mostrar aqui como estabelecer culturas gliais mistas primárias de tecido da medula espinhal do rato adulto.

Abstract

foi bem aceite que a medula espinhal respostas gliais contribuir significativamente para o desenvolvimento de dor neuropática. Informações tremenda sobre as atividades da glia nos níveis celulares e moleculares foi obtida através dos sistemas de cultura de células in vitro. Os sistemas in vitro utilizados incluem, principalmente as células da glia primária derivada de tecido cortical cerebral neonatal e linhas de células imortalizadas. No entanto, estes sistemas podem não coincidir com as características das células da glia medula espinal in vivo. A fim de investigar o papel das células cabo gliais da coluna vertebral em desenvolvimento de nervo periférico dor neuropática induzida por lesão utilizando um sistema de cultura que reflete melhor a condição in vivo, nosso laboratório tem desenvolvido um método para estabelecer medula espinal primária culturas gliais mistas a partir de camundongos adultos. Em resumo, a espinal medula são coletadas de ratos adultos e processado através de digestão com papaína seguido pela remoção da mielina com tocasdade de gradiente médio. As suspensões de células isoladas são cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco completa (cDMEM) suplementado com 2-mercaptoetanol (2-ME) a 35,9 ^o C. Estas condições de cultura foram optimizado especificamente para o crescimento de células gliais mistas. Sob estas condições, as células estão prontas para serem utilizados para a experimentação entre 12 – 14 d (células são geralmente em fase log durante este tempo) após o estabelecimento da cultura (D 0) e pode ser mantido em condições de cultura até a D 21. este sistema de cultura pode ser utilizada para investigar as respostas de células gliais medula espinal após estimulação com várias substâncias e agentes. Além da dor neuropática, este sistema pode ser usado para estudar as respostas gliais em outras doenças que envolvem alterações patológicas das células gliais medula espinhal.

Introduction

A dor crônica é um problema de saúde grave que afeta cerca de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos, com um custo anual estimado de até 635.000.000.000 $ ^1. Evidências crescentes indicou uma contribuição significativa de células gliais medula espinhal no desenvolvimento da dor neuropática, um dos tipos mais devastadores da dor crônica ^2. Um sistema in vitro cultura própria ajudaria significativamente em investigar mais os papéis de células gliais nos níveis celulares e moleculares.

Atualmente, os sistemas in vitro de cultura gliais utilizados pelos investigadores incluem principalmente células gliais derivadas de tecidos corticais de rato ou rato cérebros neonatal e linhas celulares imortalizadas gliais derivadas de rato neonatal ou rato células gliais primários. Neonatal células contêm um número significativo de células indiferenciadas que podem ainda ser diferenciadas em células gliais (astrócitos e principalmente da microglia), proporcionando assim umcélulas bundant para o uso experimental ^3. No entanto, o nosso estudo anterior demonstrou que as células da glia cerebral neonatal responderam significativamente diferente a partir de células gliais medula espinal adultos mediante a estimulação de lipopolissacárido (LPS). Por exemplo, a interleucina (IL) -4 exibido aumenta os efeitos inibidores sobre o óxido nítrico induzida por LPS (NO) em células da glia de ratos adultos da medula espinal em comparação com as células da glia cerebral neonatal ^4. Além disso, os perfis de produção de quimioquina após estimulação por um neuropeptídeo, calcitonina péptido relacionado com o gene da calcitonina (CGRP), são indiscutivelmente diferente entre as células da glia cerebral do rato neonatal (métodos descritos no Exemplo de Ref. 5) e de ratinho adulto espinal medula glia (Figura 1). As linhas celulares estabelecidas são fáceis de utilizar e de manter e pode fornecer um grande número de células num período de tempo curto. Em geral, as linhas celulares imortalizadas são gerados utilizando um sistema de imortalizao mediada por vírus (tais como a linha de células da microglia amplamente utilizado BV2) ^{6, 7} ou seguinte the identificação de transformação espontânea (tal como a linha de células de astrócitos C8-D1A e linha de células da microglia C8-B4) ^{8, 9,} as linhas de células são excelentes no estudo das características moleculares dos astrócitos e microglia individualmente.; No entanto, os resultados obtidos a partir de linhas celulares exigem sempre uma validação adicional das células primárias ou em condições in vivo. Deve também notar-se que não houve um relato de uma linha de células da glia, que é derivada de uma medula espinal glia roedor.

Para ajudar a investigar o papel das células do cordão gliais da coluna vertebral no desenvolvimento de dor neuropática, num sistema de cultura que é derivado a partir da medula espinal do rato adulto foi desenvolvido por adaptação de um método previamente relatado usado para gerar ratos adultos culturas gliais mistas ^{4, 5} . A cultura de células gliais da medula espinal do rato foi ainda mais refinado recentemente ¹⁰ e é descrito em mais detalhe neste artigo. Adultas da medula espinal misturado culturas gliais cum ser estabelecida com um rato a partir de estirpes seleccionadas que se encaixam as necessidades do estudo particular, e as células podem ser mantidas em cultura durante até 21 dias após o inicio da cultura. Este método pode ser utilizado em estudos de dor neuropática, bem como em investigações de várias doenças neurológicas que envolvem alterações patológicas no interior da medula espinal, tais como esclerose amiotrófica lateral (ALS), o vírus da imunodeficiência humana (HIV) -associated neuropatia sensorial, e múltiplos A esclerose múltipla (MS).

Protocol

O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Nova Inglaterra. O protocolo seguinte é para a preparação de culturas gliais de rato adulto 4 medulas espinhais. 1. Preparação de Soluções em uma capa de cultura sob condições assépticas Preparar meios de cultura: modificação de meio de Eagle (cDMEM) contendo DMEM completo de Dulbecco (com 4,5 g / L de glucose), 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), 2 mM de L-glutam…

Representative Results

Este método pode ser utilizado para preparar células gliais mistas de ambos os ratinhos e ratos. O número total de células médio por poço numa placa de 12 poços em D 12 pós-iniciação da cultura deve ser relativamente estável, com cerca de 100000 células por poço, quando as células são derivadas de medulas espinais de rato. As células da glia obtidos com este método pode ser utilizado em experiências que se destinam a examinar adultos respostas cabo gliais espinal após …

Discussion

É crítico para executar todas as etapas-incluindo os meios de comunicação Alterar o horário-de maneira consistente, a fim de obter resultados reprodutíveis entre experimentos. Os passos seguintes são particularmente crítico na obtenção de excelente qualidade adulto glia mista.

A digestão enzimática é um aspecto importante deste protocolo. É crucial que os pedaços de tecido são bem digerido, a fim de se obter uma suspensão de célula única. No entanto, o excesso de digestão…

Materials

Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose	Lonza	12-709F	The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.
2-mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Individual components of this kit can be purchased separately.
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY406	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA	R&D Systems	DY410	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R&D Systems	DY466	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set	BD Biosciences	555260	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	17-0451	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)	eBioscience	11-0112	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	BD Accuri C6	Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.