Preparación de mezcla de culturas gliales primarios de ratón adulto espinal tejido del cordón
Summary
El desarrollo del dolor neuropático implica cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal. Se carece de un sistema de cultivo glial fiable derivada de tejido de la médula espinal adulta y diseñado para el estudio de estas células in vitro. Por lo tanto, se muestra aquí cómo establecer cultivos mixtos gliales primarios a partir de tejido de médula espinal de ratón adulto.
Abstract
Ha sido bien aceptado que la médula espinal respuestas gliales contribuyen significativamente al desarrollo del dolor neuropático. Información relativa a las actividades tremenda gliales en los niveles celular y molecular ha sido obtenida a través de los sistemas de cultivo celular in vitro. Los sistemas in vitro utilizados, incluyen principalmente la glía primaria derivada de tejido cortical cerebral neonatal y líneas celulares inmortalizadas. Sin embargo, estos sistemas no siempre son representativas de las características de las células gliales de la médula espinal in vivo. Con el fin de investigar más a fondo el papel de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo de los nervios periféricos del dolor neuropático inducido por lesión usando un sistema de cultivo que mejor refleja la condición in vivo, nuestro laboratorio ha desarrollado un método para establecer la médula espinal primaria cultivos gliales mixtos a partir de ratones adultos. Brevemente, las médulas espinales se recogen de los ratones adultos y procesados a través de la digestión con papaína seguido de la eliminación de la mielina con un densdad-gradiente medio. Suspensiones de células individuales se cultivan en medio de Eagle modificado de Dulbecco completo (cDMEM) suplementado con 2-mercaptoetanol (2-ME) en 35,9 o C. Estas condiciones de cultivo fueron optimizadas específicamente para el crecimiento de las células gliales mixtos. En estas condiciones, las células están listas para ser utilizado para la experimentación entre 12 – 14 d (células son por lo general en la fase de registro durante este tiempo) después del establecimiento del cultivo (D 0) y pueden ser mantenidos en condiciones de cultivo hasta D 21. Este sistema de cultivo se puede utilizar para investigar las respuestas de las células gliales de la médula espinal a la estimulación con diversas sustancias y agentes. Además del dolor neuropático, este sistema puede ser utilizado para estudiar las respuestas gliales en otras enfermedades que implican cambios patológicos de las células gliales de la médula espinal.
Introduction
El dolor crónico es un problema de salud grave que afecta a aproximadamente 100 millones de adultos en los Estados Unidos, con un coste anual estimado de hasta $ 635 billón 1. La creciente evidencia ha indicado una contribución significativa de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, uno de los tipos más devastadores de dolor crónico 2. Un sistema adecuado de cultivo in vitro podría ayudar significativamente en la investigación aún más las funciones de las células gliales en los niveles celular y molecular.
En la actualidad, los sistemas de cultivo in vitro gliales pt utilizadas por los investigadores incluyen principalmente células gliales derivadas de tejidos corticales neonatales de ratón o rata cerebros y inmortalizados líneas de células gliales derivadas de ratón o rata neonatal células gliales primarios. células neonatales contienen un número significativo de células no diferenciadas que se pueden diferenciar aún más en las células gliales (astrocitos y microglia principalmente), proporcionando así unacélulas bundant para el uso experimental 3. Sin embargo, nuestro estudio anterior ha demostrado que las células gliales del cerebro neonatal respondieron significativamente diferente de las células gliales de la médula espinal para adultos a la estimulación de lipopolisacárido (LPS). Por ejemplo, la interleucina (IL) -4 muestran mejorada efectos inhibidores sobre el óxido nítrico inducida por LPS (NO) en la rata adulta glia médula espinal en comparación con células gliales del cerebro neonatal 4. Además, los perfiles de producción de quimioquinas tras la estimulación por un neuropéptido, la calcitonina péptido relacionado con el gen (CGRP), son indiscutiblemente diferente entre glia cerebro de ratón neonatal (métodos descritos en la Ref. 5) y de ratón adulto médula espinal glia (Figura 1). líneas celulares establecidas son fáciles de usar y de mantener y pueden proporcionar un gran número de células en un período de tiempo corto. En general, las líneas celulares inmortalizadas son generados ya sea usando un sistema de inmortalización mediada por virus (tales como la línea celular microglial ampliamente utilizado BV2) 6, 7 o después de THe identificación de transformación espontánea (tal como la línea celular de astrocitos C8-D1A y la línea celular microglial C8-B4) 8, 9 líneas celulares son excelentes en el estudio de las características moleculares de los astrocitos y microglia individualmente.; sin embargo, los resultados obtenidos de líneas celulares siempre requieren una validación adicional en las células primarias o en condiciones in vivo. También hay que señalar que no ha habido un informe de una línea celular glial que se deriva de un glia de la médula espinal de roedores.
Para ayudar a la investigación de la función de las células gliales de la médula espinal en el desarrollo del dolor neuropático, un sistema de cultivo que se deriva de la médula espinal de ratón adulto se ha desarrollado mediante la adaptación de un método reportado previamente utilizado para generar de rata adulta cultivos gliales mixtos 4, 5 . El cultivo glial médula espinal de ratón se refinó aún más recientemente 10 y se describe en más detalle en este artículo. Adultas de la médula espinal mezclado culturas gliales cSe establecerá una con un ratón a partir de cepas seleccionadas que se adapten a las necesidades del estudio en particular, y las células se pueden mantener en cultivo durante hasta 21 días después del inicio del cultivo. Este método se puede utilizar en estudios de dolor neuropático, así como en las investigaciones de diversas enfermedades neurológicas que implican cambios patológicos en la médula espinal, tales como la esclerosis amiotrófica lateral (ALS), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) -asociado neuropatía sensorial, y múltiple la esclerosis (MS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Es fundamental para llevar a cabo todos los pasos, incluyendo el cambio de horario, de manera coherente con el fin de obtener resultados reproducibles entre los experimentos medios de comunicación. Los siguientes pasos son particularmente críticos para obtener una excelente calidad de adultos glía mixta.
La digestión enzimática es un aspecto importante de este protocolo. Es crucial que las piezas de tejido son bien digerido con el fin de obtener una suspensión de células individuales….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Adult spinal cord mixed cultures were first developed using rats with grant support from an NIH/NIDA R01 award (PI De Leo) and an NIH T32 training grant (PI Green). These methods were further adapted for mouse spinal cords with support from the following grants: NIH/NIDA 5K01DA023503 (PI Cao), NIH/NINDS 5R21NS066130 (PI Cao), and NIH/NIGMS P20GM103643 (PI Meng). The authors would also like to thank Dr. Alejandro M. S. Mayer, Department of Pharmacology, Chicago College of Osteopathic Medicine, for his technical help in obtaining microglia-rich mixed glial cells.
Materials
| Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose | Lonza | 12-709F | The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media. |
| L-Glutamine (100x) | Lonza | 17-605E | The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine. |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) | Corning-Mediatech | 30-004-CI | This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component. |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | Sigma-Aldrich | M3148 | A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis. |
| Papain dissociation system | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Individual components of this kit can be purchased separately. |
| Percoll | GE Health Care | 17-0891-01 | Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed. |
| Lab-line incubator/shaker | Barstead/Lab-line | MaxQ4000 | This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead. |
| Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595 | Sigma-Aldrich | L-9764 | Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary. |
| Mouse IL-6 DuoSet ELISA | R&D Systems | DY406 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA | R&D Systems | DY410 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA | R&D Systems | DY466 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set | BD Biosciences | 555260 | Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers. |
| Mouse chemokine Q-Plex | Quansys Biosciences | 120251MS | This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis. |
| APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11) | eBioscience | 17-0451 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70) | eBioscience | 11-0112 | Antibody of the same clone but from other vendors can be used. |
| Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | BD Accuri C6 | Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers. |
| FlowJo software | Tree Star, Inc. | FlowJo7.6.5 | Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers. |
Referências
- Gaskin, D. J., Richard, P. The economic costs of pain in the United States. J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).
- Ji, R. R., Berta, T., Nedergaard, M. Glia and pain: Is chronic pain a gliopathy?. Pain. 154 (01), S10-S28 (2013).
- Ni, M., Aschner, M., Maines, M. D. Neonatal rat primary icroglia: isolation, culturing and selected applications. Curr Protoc Toxicol. , (2010).
- Cao, L., Fei, L., Chang, T. T., DeLeo, J. A. Induction of interleukin-1beta by interleukin-4 in lipopolysaccharide-treated mixed glial cultures: microglial-dependent effects. J Neurochem. 102 (2), 408-419 (2007).
- Malon, J. T., Maddula, S., Bell, H., Cao, L. Involvement of calcitonin gene-related peptide and CCL2 production in CD40-mediated behavioral hypersensitivity in a model of neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 7 (2-4), 117-128 (2011).
- Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf / v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27 (2), 229-237 (1990).
- Bocchini, V., et al. An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J Neurosci Res. 31 (4), 616-621 (1992).
- Alliot, F. O., Marty, M. C., Cambier, D., Pessac, B. A spontaneously immortalized mouse microglial cell line expressing CD4. Dev Brain Res. 95 (1), 140-143 (1996).
- Alliot, F. O., Pessac, B. Astrocytic cell clones derived from established cultures of 8-day postnatal mouse cerebella. Brain Res. 306 (1-2), 283-291 (1984).
- Malon, J. T., et al. Microglial content-dependent inhibitory effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on murine retroviral infection of glial cells. J Neuroimmunol. 279, 64-70 (2015).
- Cao, L., DeLeo, J. A. CNS Infiltrating CD4(+) T lymphocytes Contribute to Murine Spinal Nerve Transection-Induced Neuropathic Pain. Eur J Immunol. 38 (2), 448-458 (2008).
- Mayer, A. M., et al. Effect of a short-term in vitro exposure to the marine toxin domoic acid on viability, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-9 and superoxide anion release by rat neonatal microglia. BMC Pharmacol. 1, 7 (2001).
- Lawson, L. J., Perry, V. H., Dri, P., Gordon, S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neurociência. 39 (1), 151-170 (1990).
- Rock, R. B., et al. Role of Microglia in Central Nervous System Infections. Clin Microbiol Rev. 17 (4), 942-964 (2004).
- Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The Role of Microglia in Central Nervous System Immunity and Glioma Immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
