Framställning av primära blandade Glial kulturer från vuxen mus ryggmärg

Summary

Utvecklingen av neuropatisk smärta innebär patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller. Ett pålitligt gliaceller odlingssystemet som härrör från vuxna ryggmärgsvävnad och utformade för att studera dessa celler in vitro saknas. Därför visar vi här hur man kan upprätta primära blandade gliaceller kulturer från vuxen mus ryggmärg.

Abstract

Det har väl accepterat att ryggmärgen gliaceller svar bidrar i hög grad till utvecklingen av neuropatisk smärta. Enorma information om gliaceller aktiviteter på cellulär och molekylär nivå har erhållits genom in vitro cellodlingssystem. De in vitro-system som används, omfattar huvudsakligen primära glia härledd från neonatal hjärna kortikal vävnad och odödliggjorda cellinjer. Dock kan dessa system inte speglar egenskaperna hos ryggmärgs gliaceller in vivo. För att ytterligare undersöka rollerna för ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av perifer nervskada inducerad neuropatisk smärta med ett odlingssystem som bättre speglar in vivo tillstånd, har vårt laboratorium utvecklat en metod för att fastställa primär ryggmärgs blandade gliaceller kulturer från vuxna möss. I korthet är ryggmärg in från vuxna möss och bearbetas genom papaindigestion följt av myelin avlägsnande med hålorhet-gradient medium. Enkelcellsuspensioner odlas i fullständigt Dulbeccos modifierade Eagle-medium (cDMEM) kompletterat med 2-merkaptoetanol (2-ME) vid 35,9 ^° C Dessa odlingsbetingelser optimerades speciellt för tillväxten av blandade gliaceller. Under dessa betingelser, cellerna är redo att användas för experiment mellan 12-14 d (celler är vanligen i log-fasen under denna tid) efter upprättandet av kulturen (D 0) och kan hållas i odlingsbetingelser upp till D 21. detta odlingssystem kan användas för att undersöka svaren från ryggmärgs gliaceller vid stimulering med olika substanser och agenter. Förutom neuropatisk smärta, kan detta system användas för att studera gliaceller svar i andra sjukdomar som involverar patologiska förändringar av ryggmärgs gliaceller.

Introduction

Kronisk smärta är ett allvarligt hälsoproblem som drabbar cirka 100 miljoner vuxna i USA, med en uppskattad årlig kostnad på upp till $ 635.000.000.000 ^ett. Montera bevis har visat ett betydande bidrag av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, en av de mest förödande typer av kronisk smärta ^2. En riktig odling in vitro-systemet skulle bidra avsevärt under ytterligare undersöka rollerna för gliaceller på cellulär och molekylär nivå.

För närvarande är de in vitro-gliaceller kultursystem som används av forskare omfattar huvudsakligen gliaceller erhållna från kortikala vävnader från neonatala musen eller råtthjärnor och immortaliserade gliala cellinjer härledda från neonatal mus eller råtta primära gliaceller. Neonatala celler innehåller ett betydande antal odifferentierade celler som kan ytterligare differentieras till gliaceller (främst astrocyter och mikroglia), vilket ger enbundant celler för experimentell användning ^3. Dock har vår tidigare studie visat att neonatal hjärn gliaceller svarade signifikant annorlunda än vuxna ryggmärgen gliaceller på lipopolysackarid (LPS) stimulering. Till exempel, interleukin (IL) -4 som visas förstärkt hämmande effekter på LPS-inducerad kväveoxid (NO) produktion i vuxen råtta ryggmärgen Glia jämfört med neonatal hjärna glia ^4. Vidare profilerna av kemokinproduktion efter stimulering genom en neuropeptid, kalcitonin-gen-relaterad peptid (CGRP), är obestridligen olika mellan neonatal mushjärna glia (metoder som beskrivs i ref. 5) och vuxen mus ryggmärg glia (Figur 1). Etablerade cellinjer är lätta att använda och underhålla och kan ge ett stort antal celler i en kort tidsperiod. I allmänhet immortaliserade cellinjer genereras antingen med användning av ett virus-medierad immortalisering systemet (såsom utbredda microglial cellinje BV2) ^{6, 7} eller efter the identifiering av spontan transformation (såsom astrocyt cellinjen C8-D1A och microglial cellinje C8-B4) ^{8, 9} Cellinjer är utmärkta i att studera de molekylära egenskaperna hos astrocyter och mikroglia individuellt.; emellertid de resultat som erhållits från cellinjer kräver alltid ytterligare validering i primära celler eller i in vivo-betingelser. Det bör också noteras att det inte har funnits en rapport av en glia-cellinje som är härledd från en gnagare ryggmärgen glia.

Att hjälpa till att undersöka rollen av ryggmärgs gliaceller i utvecklingen av neuropatisk smärta, ett kultursystem som är härledd från vuxen mus ryggmärg har utvecklats genom att anpassa en tidigare rapporterade metoden som används för att generera från vuxen råtta blandade gliaceller kulturer ^{4, 5} . musen ryggmärgen gliaceller kulturen ytterligare förfinas nyligen ¹⁰ och beskrivs mer detaljerat i den här artikeln. Vuxna ryggmärgen blandade gliaceller kulturer cen upprättas med en mus från utvalda stammar som passar behoven hos den särskilda studien, och celler kan upprätthållas i odling under upp till 21 d lägga initiering av kulturen. Denna metod kan användas i neuropatiska smärtstudier, samt i undersökningar av olika neurologiska sjukdomar som involverar patologiska förändringar i ryggmärgen, såsom amyotrofisk lateralskleros (ALS), humant immunbristvirus (HIV) -associated sensorisk neuropati och multipel skleros (MS).

Protocol

Följande protokoll godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of New England. Följande protokoll är för framställning av gliaceller kulturer från fyra vuxna mus ryggmärg. 1. Beredning av lösningar i en kultur Hood under aseptiska förhållanden Förbereda odlingsmedia: komplett Dulbeccos modifikation av Eagles medium (cDMEM) innehållande DMEM (med 4,5 g / L glukos), 10% fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 lU / ml …

Representative Results

Denna metod kan användas för att framställa blandade gliaceller från både möss och råttor. Det genomsnittliga totala antalet celler per brunn i en 12-brunnar på D 12 post-initiering av kulturen bör vara relativt stabil, med ungefär 100.000 celler per brunn när celler är härledda från mus ryggmärg. Gliaceller erhållna från denna metod kan användas i experiment som är utformade för att undersöka vuxna ryggmärgen gliaceller svar vid administrering av ämnen och agenter…

Discussion

Det är viktigt att utföra alla steg-inklusive medierna förändras schema på ett konsekvent sätt i syfte att erhålla reproducerbara resultat mellan experiment. Följande steg är särskilt kritisk för att erhålla utmärkt kvalitet vuxen blandad glia.

Den enzymatiska nedbrytning är en viktig aspekt av detta protokoll. Det är avgörande att vävnaden bitar är väl-digererad för att erhålla en enkelcellsuspension. Dock kommer över matsmältning leda till betydligt färre celler. Va…

Materials

Dulbecco’s modification of Eagle’s media (DMEM) with 4.5g/L glucose	Lonza	12-709F	The cDMEM media is a standard, widely used culture media. Individual researcher can decide where to purchase the DMEM and all other component used to make cDMEM media.
L-Glutamine (100x)	Lonza	17-605E	The L-glutamine is a standard, widely used component for various culture media. Individual researcher can decide where to purchase L-glutamine.
Antibiotic-Antimycotic Solution (100x)	Corning-Mediatech	30-004-CI	This is a combination of penicillin, streptomycin and Amphotericin formulated to contain 10,000 units/ml penicillin G, 10 mg/ml streptomycin sulfate and 25 µg/ml amphotericin B. Individual researcher can decide where to purchase individual component.
2-mercaptoethanol (2-ME)	Sigma-Aldrich	M3148	A BioReagent, suitable for cell culture, molecular biology and electrophoresis.
Papain dissociation system	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Individual components of this kit can be purchased separately.
Percoll	GE Health Care	17-0891-01	Percoll is sold as sterile solution. Undiluted Percoll can be re-autoclaved if needed.
Lab-line incubator/shaker	Barstead/Lab-line	MaxQ4000	This is the incubator/shaker we have currently. Other types of shakers can be used instead.
Lipopolysaccharides, Salmonella Minnesota Re595	Sigma-Aldrich	L-9764	Other strains of LPS can also induce glial responses. The magnitude of the responses may vary.
Mouse IL-6 DuoSet ELISA	R&D Systems	DY406	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse TNF-alpha DuoSet ELISA	R&D Systems	DY410	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse IP-10 (CXCL10) DuoSet ELISA	R&D Systems	DY466	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse MCP-1 (CCL2) ELISA Opteia set	BD Biosciences	555260	Each individual Researcher can select the ELISA kit he or she prefers.
Mouse chemokine Q-Plex	Quansys Biosciences	120251MS	This product was available for in-house assay at the time. Instead, we sent out samples to the manufacturer for analysis.
APC-anti-mouse-CD45 (clone 30-F11)	eBioscience	17-0451	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
FITC-anti-mouse-CD11b (clone M1/70)	eBioscience	11-0112	Antibody of the same clone but from other vendors can be used.
Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	BD Accuri C6	Each individual Researcher can use any flow cytometer he or she prefers.
FlowJo software	Tree Star, Inc.	FlowJo7.6.5	Each individual Researcher can use any analysis software he or she prefers.