La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

Abstract

enfermedades neurodegenerativas progresivas, como la enfermedad de Alzheimer (EA) o la enfermedad de Parkinson (EP) son una amenaza creciente para la salud humana en todo el mundo. Aunque los modelos de mamíferos han aportado importantes conocimientos sobre los mecanismos subyacentes de la patogenicidad, la complejidad de los sistemas de mamíferos, junto con sus altos costos están limitando su uso. Por lo tanto, la simple pero bien establecido modelo de sistema de Drosophila ofrece una alternativa para la investigación de las vías moleculares que se ven afectados en estas enfermedades. Además de anomalías de comportamiento, enfermedades neurodegenerativas se caracterizan por fenotipos histológicos tales como la muerte neuronal y axonopatía. Para cuantificar la degeneración neuronal y para determinar cómo se ve afectada por factores genéticos y ambientales, usamos un enfoque histológico que se basa en la medición de las vacuolas en el cerebro de moscas adultas. Para minimizar los efectos del error sistemático y la comparación directa de las secciones de control y experimental moscas en una preparación, que utilizan el método de "cuello" de las secciones de parafina. La neurodegeneración se evalúa a continuación, midiendo el tamaño y / o número de vacuolas que se han desarrollado en el cerebro de la mosca. Esto se puede hacer ya sea centrándose en una región específica de interés o mediante el análisis de todo el cerebro mediante la obtención de secciones en serie que abarcan la cabeza completa. Por lo tanto, este método permite medir no sólo la degeneración severa, pero también fenotipos relativamente suaves que sólo son detectables en algunas secciones, como ocurre durante el envejecimiento normal.

Introduction

Con el aumento de la esperanza de vida, las enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson se han convertido en una amenaza creciente para la salud de la población en general. De acuerdo con los Institutos Nacionales de la Salud, 115 millones de personas en todo el mundo se prevé que se afectados por la demencia en 2050. Aunque se han hecho progresos significativos en la identificación de los genes y los factores de riesgo implicados en al menos algunas de estas enfermedades, para muchos de ellos, el subyacente mecanismos moleculares aún no se conocen o no se entiende bien.

Simples organismos modelo de invertebrados como Caenorhabditis elegans y Drosophila melanogaster ofrecen una variedad de ventajas experimentales para estudiar los mecanismos de las enfermedades neurodegenerativas, incluyendo un ciclo de corta vida, gran número de progenie, y la disponibilidad de métodos genéticos y moleculares bien establecidos y, a veces únicos ^{1 -12.} Además, estos organismos son susceptibles de imparcialpantallas de interacción que pueden identificar los factores que contribuyen a estas enfermedades por sus efectos agravantes o mejorar en fenotipos neurodegenerativos.

El análisis de estas interacciones genéticas y la evaluación de los efectos del envejecimiento requiere protocolos cuantitativos para detectar la neurodegeneración y para medir su gravedad. Esta evaluación puede hacerse con relativa facilidad en la medición de los aspectos de comportamiento en Drosophila, como el aprendizaje olfativo, geotaxis negativos, o fototaxis rápido, que proporcionan un valor numérico rendimiento ^13-21. También es posible determinar los efectos sobre la supervivencia neuronal contando las neuronas. Sin embargo, esto sólo es posible cuando se centra en una población específica que se pueda identificar claramente, al igual que las neuronas dopaminérgicas que se ven afectados en la enfermedad, e incluso entonces, los resultados han sido controvertidos ^22-24.

El protocolo descrito aquí utiliza el método de cuello para realizar secciones en serie de parafina, un métodoque fue desarrollado originalmente por Heisenberg y Böhl, que lo utilizó para aislar mutantes anatómicas cerebrales en Drosophila ^25. El uso del método de cuello posteriormente se ha adaptado, incluso en criosecciones, vibratome secciones y secciones de plástico ^{de 26-28.} Aquí, se emplea este método para obtener secciones en serie de toda la cabeza de la mosca, que luego se puede utilizar para medir las vacuolas que se desarrollan en las moscas con fenotipos neurodegenerativas ^16,21,29-32. Estas mediciones se pueden hacer en áreas específicas del cerebro o pueden cubrir todo el cerebro; el último enfoque permite identificar incluso débiles fenotipos degenerativas, como se observa durante el envejecimiento. Por último, cuando se utilizan los collares, hasta 20 moscas pueden ser procesados ​​como una preparación, que no sólo es menos tiempo, sino que también permite el análisis de control y las moscas experimentales en la misma preparación, minimizando artefactos debido a ligeros cambios en la preparación.

Protocol

1. La fijación de la cabeza sobre los cuellos y inclusión en parafina Nota: Todos los pasos en el proceso de fijación debe hacerse en una campana de humos. Metilbenzoato, mientras que no plantean un riesgo para la salud, tiene un olor muy distinto, que puede ser abrumador si no se manejan en una campana de humos. Antes de anestesiar las moscas, conforman 50 ml de solución de Carnoy mediante la adición de 15 ml de cloroformo y 5 ml de ácido acético glacial y 30 ml de etanol al 99% (no mezcle el …

Representative Results

Utilizando los resultados método descrito en secciones seriadas teñidas por el pigmento del ojo 33 que abarcan toda la cabeza de la mosca. A parte de esto se muestra en la Figura 1B, donde las secciones de una cabeza individuales se muestran de arriba a abajo. Las secciones de diferentes moscas son vistos de izquierda a derecha en este ejemplo. Para facilitar la orientación y la identificación de las moscas, una mosca sin ojos (oculis sinusoidales)</em…

Discussion

El método descrito proporciona un medio para cuantificar la neurodegeneración en el cerebro de Drosophila. Mientras que otros métodos, como contar un tipo celular específico, se pueden utilizar para identificar la neurodegeneración, la ventaja de este método es que se puede aplicar de forma más general. Contando las células requiere que estas células pueden ser identificados de forma fiable utilizando un anticuerpo específico o la expresión de un marcador específico de célula, lo que no siempre est…

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500