Mass histologie te kwantificeren Neurodegeneratie in<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila wordt veel gebruikt als een modelsysteem om neurodegeneratie. Dit protocol beschrijft een methode waarbij degeneratie, zoals bepaald door vacuole-vorming in de hersenen, kan worden gekwantificeerd. Het minimaliseert ook effecten als gevolg van de experimentele procedure van de verwerking en snijden controle en experimentele vliegen als een monster.

Abstract

Progressieve neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD) is een toenemend gevaar voor de volksgezondheid wereldwijd. Hoewel zoogdierlijke modellen belangrijke inzichten verschaft in de onderliggende mechanismen van pathogeniciteit, de complexiteit van zoogdierlijke systemen met hun hoge kosten beperken het gebruik ervan. Daarom is de eenvoudige, maar goed ingeburgerde Drosophila model-systeem biedt een alternatief voor het onderzoeken van de moleculaire pathways die worden beïnvloed bij deze ziekten. Naast afwijkend gedrag, zijn neurodegeneratieve ziekten gekenmerkt door histologische fenotypes zoals neuronale dood en axonopathie. Neuronale degeneratie kwantificeren en te bepalen hoe deze wordt beïnvloed door genetische en omgevingsfactoren, gebruiken we een histologische benadering die is gebaseerd op het meten van de vacuolen bij volwassen vliegen hersenen. Om de effecten van systematische fout te minimaliseren en om direct te vergelijken secties van de bedienings- en experimental vliegen in één preparaat, gebruiken we de 'kraag' methode voor paraffine secties. Neurodegeneratie wordt vervolgens beoordeeld door het meten van de afmeting en / of het aantal vacuolen die zijn ontstaan ​​in de vlieg hersenen. Dit kan worden gedaan door te focussen op een specifiek gebied van belang of door analyse van de hele hersenen door het verkrijgen van seriecoupes dat de volledige kop overspannen. Daarom is deze werkwijze kan men niet alleen de degeneratie maar ook relatief mild fenotypes die alleen detecteerbaar in enkele secties te meten, zoals optreedt tijdens normale veroudering.

Introduction

Met de stijging van de levensverwachting, hebben neurodegeneratieve ziekten als Alzheimer of Parkinson's een steeds grotere bedreiging voor de algemene bevolking gezondheid geworden. Volgens de National Institutes of Health, 115 miljoen mensen wereldwijd wordt voorspeld te worden getroffen door dementie in 2050. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de identificatie van genen en risicofactoren betrokken bij ten minste enkele van deze ziekten, voor velen van hen, de onderliggende moleculaire mechanismen zijn nog onbekend of niet goed begrepen.

Eenvoudige ongewervelde modelorganismen zoals Caenorhabditis elegans pt Drosophila melanogaster bieden een verscheidenheid aan experimentele voordelen aan de mechanismen van neurodegeneratieve ziekten, met inbegrip van een korte levenscyclus, groot aantal nakomelingen, en de beschikbaarheid van gevestigde en soms unieke genetische en moleculaire methoden ¹ bestuderen ^-12. Bovendien zijn deze organismen vatbaar onbevooroordeeldeinteractie schermen die factoren die bijdragen aan deze ziekten door hun verzwarende of verbetering van effecten op neurodegeneratieve fenotypes kunnen identificeren.

Het analyseren van dergelijke genetische interacties en de beoordeling van de vergrijzing effecten vereist kwantitatieve protocollen tot neurodegeneratie te detecteren en de ernst ervan te meten. Deze beoordeling kan relatief eenvoudig worden gedaan bij het meten van gedragsaspecten in Drosophila, zoals olfactorische leren, negatief geotaxis, of snel phototaxis, die een numerieke voorstelling waarde ^13-21 te bieden. Het is ook mogelijk om de effecten op neuronale overleving te bepalen door het tellen van neuronen. Dit is echter alleen mogelijk wanneer gericht op een specifieke populatie, dat is duidelijk herkenbaar, net als de dopaminerge neuronen die worden beïnvloed in PD, en zelfs dan zijn de resultaten controversieel ^22-24 geweest.

De hier beschreven protocol gebruikt de kraag methode paraffine seriecoupes voeren, een werkwijzedat werd oorspronkelijk ontwikkeld door Heisenberg en Böhl, die het gebruikt om anatomische hersenen mutanten te isoleren in Drosophila ^25. Het gebruik van de kraag methode is vervolgens aangepast, zoals in vriescoupes, vibratoomcoupes en plastic secties ^26-28. Hier wordt deze werkwijze toegepast op opeenvolgende coupes van de hele vlieg kop, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de vacuolen die zich ontwikkelen in vliegen met neurodegeneratieve fenotypes ^16,21,29-32 meten verkrijgen. Deze metingen kunnen worden gedaan in specifieke hersengebieden of kan de gehele hersenen bedekken; de laatste benadering maakt het mogelijk om zelfs zwakke degeneratieve fenotypes te identificeren, zoals waargenomen tijdens veroudering. Tenslotte, bij gebruik van de kragen, tot 20 vliegen worden verwerkt als één preparaat, dat niet alleen minder tijdrovend, maar ook zorgt voor de analyse van controle en experimentele vliegen in hetzelfde preparaat, geminimaliseerd artefacten als gevolg van kleine veranderingen in de voorbereiding.

Protocol

1. Vaststelling van de Hoofd op Kragen en insluiten in paraffine Opmerking: Alle stappen in het bevestigingsorgaan proces moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Methylbenzoaat, terwijl niet het stellen van een risico voor de gezondheid, heeft een zeer aparte geur, die overweldigend kan zijn als niet in een zuurkast behandeld. Voordat verlamming de vliegen, make-up 50 ml Carnoy-oplossing door het toevoegen van 15 ml chloroform en 5 ml ijsazijn en 30 ml van 99% ethanol (niet de chloroform en azijnzuur …

Representative Results

Met behulp van de beschreven methode resulteert in seriecoupes gekleurd door het oog pigment 33 die de hele vlieg kop omvatten. Een gedeelte hiervan wordt getoond in figuur 1B, waarbij de secties van een individu kop getoond van boven naar beneden. De secties van verschillende vliegen worden gezien van links naar rechts in dit voorbeeld. Oriëntatie en identificatie van de vliegen te vergemakkelijken, is een eyeless fly (sinus oculis) ingevoegd als ee…

Discussion

De beschreven werkwijze verschaft een middel om neurodegeneratie te kwantificeren in de hersenen van Drosophila. Terwijl andere methoden, zoals het tellen van een bepaald celtype, kan worden gebruikt om neurodegeneratie te identificeren, het voordeel van deze methode is dat het algemeen kan worden toegepast. Tellen cellen vereist dat deze cellen op betrouwbare wijze kunnen worden geïdentificeerd met behulp van een specifiek antilichaam of de expressie van een cel-specifieke marker, die niet altijd beschikbaar …

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500