Mass histologi att kvantifiera neurodegeneration i<em> Drosophila</em

Summary

Drosophila används allmänt som ett modellsystem för att studera neurodegeneration. Detta protokoll beskriver en metod genom vilken degeneration och som bestämts av vakuolen bildning i hjärnan, kan kvantifieras. Det minimerar även effekter på grund av den experimentella proceduren genom bearbetning och snitt kontroll och experimentella flugor som ett prov.

Abstract

Progressiva neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) eller Parkinsons sjukdom (PD) är ett växande hot mot människors hälsa över hela världen. Även däggdjurs modeller har gett viktiga insikter i de underliggande mekanismerna för patogeniciteten är komplexiteten i däggdjurssystem tillsammans med sina höga kostnader begränsar deras användning. Därför ger den enkla men väletablerad Drosophila modellsystemet ett alternativ för att undersöka de molekylära vägar som berörs i dessa sjukdomar. Förutom beteendestörningar, är neurodegenerativa sjukdomar som kännetecknas av histologiska fenotyper såsom nervcellsdöd och axonopathy. För att kvantifiera neuronal degenerering och för att bestämma hur den påverkas av genetiska och miljömässiga faktorer, använder vi en histologisk strategi som bygger på att mäta vakuoler hos vuxna fly hjärnor. För att minimera effekterna av systematiska fel och att direkt jämföra avsnitten från kontroll och experimental flugor i en beredning, använder vi "krage" metod för paraffin. Neurodegeneration bedöms sedan genom att mäta storleken och / eller antalet vakuoler som har utvecklats i farten hjärnan. Detta kan antingen ske genom att fokusera på en specifik region av intresse eller genom att analysera hela hjärnan genom att erhålla seriesnitt som spänner över hela huvudet. Därför denna metod gör det möjligt att mäta inte bara svår degeneration utan också relativt milda fenotyper som endast påvisas i några avsnitt, som sker under normalt åldrande.

Introduction

Med ökningen av medellivslängden har neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers eller Parkinsons blivit ett allt större hot mot hälsan för befolkningen i allmänhet. Enligt National Institutes of Health, över hela världen 115 miljoner människor förväntas påverkas av demens 2050. Även om betydande framsteg har gjorts när det gäller att identifiera gener och riskfaktorer som är involverade i åtminstone några av dessa sjukdomar, för många av dem, den underliggande molekylära mekanismer är fortfarande okänd eller inte väl förstått.

Enkla ryggradslösa modellorganismer som Caenorhabditis elegans och Drosophila melanogaster erbjuder en mängd olika experimentella fördelar att studera mekanismerna för neurodegenerativa sjukdomar, däribland en kort livscykel, stort antal avkomma, och tillgången på väletablerade och ibland unika genetiska och molekylära metoder ^{1 -12.} Dessutom är dessa organismer är mottagliga för objektivinteraktion skärmar som kan identifiera faktorer som bidrar till dessa sjukdomar genom sina försvårande eller lindra effekter på neurodegenerativa fenotyper.

Analysera sådana genetiska interaktioner och bedöma åldrandets effekter kräver kvantitativa protokoll för att upptäcka neurodegeneration och mäta dess svårighetsgrad. Denna bedömning kan göras relativt enkelt när man mäter beteendeaspekter i Drosophila, såsom lukt lärande, negativa geotaxis eller snabb phototaxis, som ger ett numeriskt prestationsvärdet ^13-21. Det är också möjligt att bestämma effekterna på neuronal överlevnad genom att räkna neuroner. Detta är dock endast möjligt när fokusera på en specifik population som är klart identifierbar, som dopaminerga neuroner som påverkas i PD, och även då, har resultaten varit kontroversiell ^22-24.

Protokollet som beskrivs här använder kragen metod för att utföra paraffin seriesnitt, en metodsom ursprungligen utvecklades av Heisenberg och Böhl, som använde det för att isolera anatomiska mutanter hjärnan i Drosophila ^25. Användningen av kragen metoden har därefter anpassats, bland annat i kryosnitt, vibratome sektioner och plastsektioner ^26-28. Här, är denna metod används för att erhålla seriella sektioner av hela flugan huvudet, som sedan kan användas för att mäta de vakuoler som utvecklas i flugor med neurodegenerativa fenotyper ^16,21,29-32. Dessa mätningar kan göras på särskilda områden i hjärnan eller kan täcka hela hjärnan; den senare metoden gör att man kan identifiera även svaga degenerativa fenotyper, som observerades under åldrandet. Slutligen, när man använder kragarna, upp till 20 flugor kan behandlas som en förberedelse, som inte bara är mindre tidskrävande, men också tillåter för analys av kontroll- och experiment flugor i samma beredning, vilket minimerar artefakter på grund av små förändringar i förberedelsen.

Protocol

1. Fastställande chefen på Kragar och inbäddning i paraffin Notera: Alla steg i fixeringsprocessen bör göras i ett dragskåp. Metylbensoat, utan utgör en hälsorisk, har en mycket distinkt doft, som kan vara överväldigande om de inte hanteras i ett dragskåp. Innan anesthetizing flugorna, utgör 50 ml av Carnoy lösning genom att tillsätta 15 ml kloroform och 5 ml isättika till 30 ml 99% etanol (inte blanda kloroform och ättiksyra). Häll den i en glasbehållare med en platt botten, såsom …

Representative Results

Med användning av de beskrivna metoden resulterar i seriesektioner färgade med ögat pigment 33 som omfattar hela flugan huvudet. En del av detta visas i figur 1B, där sektionerna från ett enskilt huvud visas från topp till botten. Sektionerna från olika flugor sett från vänster till höger i detta exempel. För att underlätta orienteringen och identifiering av flugorna är en eyeless fluga (sinus oculis) införas som en markör vid position …

Discussion

Den beskrivna metoden tillhandahåller ett medel för att kvantifiera neurodegeneration i hjärnan hos Drosophila. Medan andra metoder, som räknar en specifik celltyp, kan användas för att identifiera neurodegeneration, är fördelen med denna metod att den kan tillämpas mer generellt. Räkna celler kräver att dessa celler tillförlitligt kan identifieras med användning av antingen en specifik antikropp eller uttrycket av en cellspecifik markör, vilket inte alltid är tillgänglig. Vidare har det visats …

Materials

Name of the Reagent/Equipment	Company	Catalog Number
Collar	Genesee Scientific	TS 48-100	We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A discription to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
Rubber ice cube tray for embedding	Household store		The size can be made to fit by glueing in additional walls
Crystallizing dish	Fisher Scientific company	08-762-3
Ether	Fisher Scientific Company	E138-1
Ethanol	Decon Laboratories Inc.	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	Distinct Odor
Use in fume hood
Low Melting Point Paraffin Wax	Fisher Scientific Company	T565	Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
Microscope Slide	Fisher Scientific Company	12-550D
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific Company	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	Three different containers for washes
Vertical Staining Jar with Cover	Ted Pella Inc.	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
Poly-L-lysine Solution	Sigma Life Science	P8290-500