Visualizando o Tissue interrenais Steroidogenic e sua Vascular Microenvironment em Zebrafish

Resumo

A glândula interrenal no peixe-zebra é a contrapartida teleósteos da glândula supra-renal de mamífero. Este protocolo apresenta a forma de realizar a desidrogenase de 3-hidroxiesteróides β (Δ ^5-4 isomerase; 3β-HSD) ensaio da actividade enzimática, que detecta as células diferenciadas esteroidogênicas no peixe-zebra desenvolvimento.

Resumo

Este protocolo apresenta como detectar células esteroidogênicas interrrenais diferenciadas por meio de um ensaio simples de atividade enzimática de montagem total. A identificação de tecidos esteroidogênicos diferenciados por meio da coloração histoquímica cromogênica de células positivas para a atividade da 3-β-hidroxiesteróide desidrogenase / Δ^5-4 isomerase (3β-Hsd) é fundamental para monitorar a morfologia e diferenciação dos tecidos adrenocorticais e interrenais em mamíferos e teleósteos, respectivamente. No modelo de peixe-zebra, a transparência óptica e a permeabilidade tecidual dos embriões e larvas em desenvolvimento permitem a coloração de montagem total da atividade de 3β-Hsd. Este protocolo de coloração, realizado em linhas repórteres fluorescentes transgênicas que marcam as células pronéfricas e endoteliais em desenvolvimento, permite a detecção do tecido interrenal esteroidogênico, além do rim e da vasculatura vizinha. Em combinação com secção de vibrato, imuno-histoquímica e microscopia confocal, podemos visualizar e testar o microambiente vascular dos tecidos esteroidogênicos interrenais. O ensaio de atividade de 3β-Hsd é essencial para estudar a biologia celular da glândula interrenal do peixe-zebra porque, até o momento, nenhum anticorpo adequado está disponível para rotular células esteroidogênicas do peixe-zebra. Além disso, este ensaio é rápido e simples, fornecendo assim uma ferramenta poderosa para triagens mutantes direcionadas a distúrbios genéticos adrenais (inter-renais), bem como para determinar os efeitos de interrupção de produtos químicos na esteroidogênese em estudos farmacêuticos ou toxicológicos.

Introdução

A glândula adrenal, um componente crucial do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, segrega esteróides e coordena a homeostase esteróides e na resposta do organismo ao estresse. A glândula adrenal compreende o córtex exterior, que segrega esteróides de um modo específico da zona, e medula interna, que sintetiza catecolaminas. A glândula interrenal em teleósteos é o homólogo da glândula supra-renal em mamíferos e é composto de células cromafins e interrenais esteroidogênicas, que são equivalentes funcionais do córtex adrenal e medula, respectivamente ^1-3. Estudos realizados utilizando o modelo de peixe-zebra têm relatado que ambas as linhagens celulares esteroid....

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os procedimentos experimentais no peixe-zebra foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade Tunghai (Aprovação IRB NO 101-12.) E realizado em conformidade com as orientações aprovadas.

1. As soluções de reserva para 3β-HSD Actividade Enzimática A coloração

1. Prepare trans-dehydroandrosterone [10 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO)].
2. Prepare β-nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (1,2 mg / ml em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2).
3. Prepare a nicotinamida (vitamina B3, 50 mg / ml em _H2O).
4. Prepare de tetrazólio azul nitro-4 (50 mg....

Resultados

Para determinar como as esteroidogênicas codevelops tecido interrenais com o glomérulo renal pronephric e sua vasculatura nascente, o ensaio de actividade enzimática 3β-HSD foi realizada na dupla transgénico Tg (wt1b: GFP) ^li1; Tg (kdrl: mCherry) ^CI5 embrião em 34 HPF (Figura 1). Nesta fase, o tecido esteroidogênica actividade positiva 3β-HSD está localizado à direita da linha média e caudal imediatamente para o glomérulo renal pronephric, .......

Discussão

A intensidade do sinal da actividade 3β-HSD aumentado ao longo do curso de reacção. Sinais claros de actividade 3β-HSD foram detectados após 4 horas de reacção para as fases de 28 HPF em diante. No entanto, a duração da reacção requer a determinação empírica, dependendo do objetivo do ensaio. Nos casos em que a coloração requer processamento durante a noite, um fundo ligeiramente azulado tende a desenvolver sobre as amostras. Este problema pode ser ultrapassado pelo aumento da duração de fixação (por exemplo, 4.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio confocal	Carl Zeiss	LSM510
	DMSO Sigma	D8418
Glicerol	USB	US16374
Hyclone Sérum Fetal para Bezerros	GE Healthcare Life Sciences	SH30073
Nicotinamida	Sigma	N0636
β-Nicotinamida adenina dinucleotídeo hidrato	Sigma	N1636
4-Nitro azul tetrazólio	Promega	S380C
Nusieve GTG	Lonza	50081
Paraformaldeído	Sigma	P6148
Feniltioureia	Sigma	P7629
fosfato tamponado solução salina	Sigma	P4417-100Tab
PYREX Spot Plate	Corning	7220-85
Sal de recife	AZOO	AZ28001
trans-Dehidroandrosterona	Sigma	D4000
Triton X-100	Sigma	T8787
Tween 20	Sigma	P9416
Vibratome	Leica	VT1000M