Interrenal Steroidogenic ऊतक और zebrafish में इसका संवहनी Microenvironment Visualizing
Summary
zebrafish में interrenal ग्रंथि स्तनधारी अधिवृक्क ग्रंथि के teleostean समकक्ष है। Enzymatic गतिविधि परख है, जो विकासशील zebrafish में विभेदित steroidogenic कोशिकाओं का पता लगाता है, इस प्रोटोकॉल कैसे 3-β-hydroxysteroid डिहाइड्रोजनेज (3β-एचएसडी Δ 5-4 आइसोमेरेस) प्रदर्शन करने के लिए परिचय।
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
अधिवृक्क ग्रंथि, hypothalamo-पिट्यूटरी-अधिवृक्क अक्ष का एक महत्वपूर्ण घटक है, स्टेरॉयड का स्राव होता है और स्टेरॉयड homeostasis और तनाव को शारीरिक प्रतिक्रिया समन्वय करता है। अधिवृक्क ग्रंथि बाहरी कोर्टेक्स है, जो एक क्षेत्र विशेष तरीके में स्टेरॉयड स्रावित करता है, और भीतरी मज्जा, जो catecholamines synthesizes शामिल हैं। Teleosts में interrenal ग्रंथि स्तनधारियों में अधिवृक्क ग्रंथि के समकक्ष है और steroidogenic interrenal और क्रोमाफिन कोशिकाओं है, जो अधिवृक्क प्रांतस्था और मज्जा में क्रमश: 1-3 के कार्यात्मक समकक्ष हैं से बना है। Zebrafish मॉडल का उपयोग किए गए अध्ययनों से सूचित किया है कि दोनों steroidogenic और क्रोमाफिन सेल प्रजातियों आणविक और सेलुलर तंत्र अत्यधिक स्तनधारियों 1,2 में उन जैसी से बनते हैं। इसलिए, zebrafish आनुवंशिक विकारों, neuroendocrine नियंत्रण, और hypothalamo पीयूषिका आधिवृक्क (interrenal) अक्ष के सिस्टम जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक संभावित शक्तिशाली मॉडल है।
<p clasएस = "jove_content"> अधिवृक्क ग्रंथि में, 3β-एचएसडी dehydroepiandrosterone 4,5 से 17α-hydroxypregnelolone से pregnenolone, 17α-hydroxyprogesterone से प्रोजेस्टेरोन का रूपांतरण है, और androstenedione उत्प्रेरित। 3β-एचएसडी हार्मोनल स्टेरॉयड, अर्थात् प्रोजेस्टेरोन, glucocorticoids, mineralocorticoids, एण्ड्रोजन और एस्ट्रोजेन के सभी वर्गों biosynthesizing के लिए आवश्यक है। दो मानव 3β-एचएसडी HSD3B1 isozymes और HSD3B2 विभिन्न 6 व्यक्त कर रहे हैं। HSD3B1, नाल और परिधि के ऊतकों में व्यक्त किया जबकि HSD3B2 अधिवृक्क प्रांतस्था और gonads में व्यक्त किया जाता है। मानव HSD3B1 और HSD3B2 zebrafish hsd3b1, जो interrenal ऊतक और वयस्क gonads में व्यक्त किया जाता है के सह orthologs कर रहे हैं; zebrafish hsd3b2 एक माता के रूप में व्यक्त जीन जिसका टेप जीवोत्पत्ति 7 से पहले गायब हो जाते है। zebrafish के लिए पूरे माउंट 3β-एचएसडी enzymatic गतिविधि परख के प्रोटोकॉल, लेवी की विधि को संशोधित करके विकसित किया गया था एकमिलानो एट अल द्वारा वर्णित रहा है। आठ teleost प्रजातियों 8 के जमे हुए वर्गों पर। ऊतक पारगम्यता और विकासशील zebrafish की ऑप्टिकल पारदर्शिता की वजह से पूरे माउंट 3β-एचएसडी ऊतकरसायनविज्ञान सफलतापूर्वक निश्चित zebrafish भ्रूण और लार्वा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और विशेष रूप से विभेदित interrenal ऊतकों को चित्रित।यह संवेदनशील और तेजी से परख विभिन्न म्यूटेंट और morphants interrenal dysmorphogenesis के विभिन्न प्रकार का प्रदर्शन करने के लिए लागू किया गया है। Interrenal 3β-एचएसडी गतिविधि भ्रूण जहां interrenal ऊतक के विनिर्देश Ff1b प्रतिलेखन कारक की एक विशिष्ट पछाड़ना के माध्यम से बाधित है और के रूप में interrenal भेदभाव Ff1b coregulator Prox1 9,10 के एक पछाड़ना से प्रभावित है कमी आई है में अनुपस्थित है। विशेष रूप से, 3β-एचएसडी गतिविधि, गंभीर प्रारंभिक चरण दोष के साथ म्यूटेंट में पता लगाया जा सकता है एक आंखों सिरा जैसे और भेंगापन, जहां 3β-एचएसडी ऊतकरसायनविज्ञान रूपरेखा बनाती कैसे interrenal सेल प्रवास 11 प्रभावित है। interrenal ऊतक के भेदभाव को भी रक्त वाहिका और के पूर्ण अभाव में समझौता नहीं किया है। इसलिए, कैसे endothelium व्युत्पन्न संकेतों को आकार विकासशील interrenal अंग 12,13 निर्धारित किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस histochemical परख सफलतापूर्वक zebrafish मॉडल में विनिर्देश, भेदभाव, और steroidogenic कोशिकाओं के प्रवास के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसलिए, यह एक कुशल और अधिवृक्क और interrenal अंग विकारों को लक्षित किसी भी आनुवंशिक या रासायनिक स्क्रीन के लिए एक विश्वसनीय उपकरण होना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
3β-एचएसडी गतिविधि का संकेत ताकत प्रतिक्रिया के पाठ्यक्रम में वृद्धि हुई। 3β-एचएसडी गतिविधि के स्पष्ट संकेत 28 HPF से आगे के चरणों के लिए प्रतिक्रिया के 4 घंटे बाद पता चला रहे थे। हालांकि, प्रतिक्रिया अवधि पर…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S843: Li1 और टीजी (EGFP kdrl): हम टीजी (GFP wt1b) उपहार देने के लिए प्रो क्रिस्टोफ Englert और प्रो डिडिएर Stainier धन्यवाद तनाव, क्रमशः, और उपलब्ध कराने टीजी (kdrl: mCherry) के लिए ताइवान Zebrafish कोर सुविधा ci5। यह अध्ययन विज्ञान और प्रौद्योगिकी (96-2628-बी-029-002-MY3, 101-2313-बी-029-001, 102-2628-बी-029-002-MY3 के ताइवान के मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, 102- 2321-बी-400-018)।
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
Referências
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