腎間のステロイド合成組織とゼブラフィッシュにおけるその血管微小環境の可視化
Summary
ゼブラフィッシュにおける間腎腺は、哺乳動物の副腎の硬骨魚類の対応です。酵素活性アッセイ、開発ゼブラフィッシュでは、分化ステロイド産生細胞を検出し、このプロトコルは、3-βヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ（3β-HSDΔ5-4イソメラーゼ）を実行する方法を紹介します。
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
副腎、視床下部 – 下垂体 – 副腎軸の重要な要素は、ステロイドを分泌し、ステロイドの恒常性とストレスに対する身体の応答を調整します。副腎は、カテコールアミンを合成するゾーン特異的にステロイドを分泌する外皮質、および内側髄質を含みます。硬骨魚で間腎腺はそれぞれ1-3、哺乳動物における副腎のカウンターパートであり、副腎皮質と髄質の機能的等価物であるステロイド産生腎間の及びクロム親和性細胞から構成されています。ゼブラフィッシュモデルを使用して行われた研究では、両方のステロイド産生およびクロム親和細胞系統が高哺乳類1,2のものと似た分子・細胞メカニズムによって形成されていることを報告しています。したがって、ゼブラフィッシュは、遺伝性疾患、神経内分泌制御、および視床下部 – 下垂体 – 副腎（腎間の）軸のシステム生物学を研究するための潜在的に強力なモデルです。
<p classの副腎で= "jove_content">、3β-HSDはプレグネノロン、17α-hydroxypregneloloneから17αヒドロキシプロゲステロン、およびデヒドロエピアンドロステロン4,5からのアンドロステンジオンからのプロゲステロンの変換を触媒します。 3β-HSDは、ホルモン、ステロイド、すなわちプロゲステロン、グルココルチコイド、ミネ、アンドロゲン、およびエストロゲンのすべてのクラスを生合成するために不可欠です。 2つのヒト3β-HSDはHSD3B1とHSD3B2を差動6を発現しているアイソザイム。 HSD3B2の副腎皮質および生殖腺で発現されるのに対し、HSD3B1は、胎盤および末梢組織で発現されます。人間HSD3B1とHSD3B2は間腎組織および成体の生殖腺で発現されるゼブラフィッシュhsd3b1の共同オルソログです。ゼブラフィッシュhsd3b2は、その転写産物器官7の前に姿を消す母性発現する遺伝子です。ゼブラフィッシュのための全マウント3β-HSD酵素活性アッセイのプロトコルは、レヴィの方法を変更することによって開発されましたミラノらによって記載さsの。 、8硬骨魚種8の凍結切片上。そのため組織透過性と開発ゼブラフィッシュの光透過性の、ホールマウント3β-HSDの組織化学が正常に固定ゼブラフィッシュの胚および幼生のために使用され、特に区別腎間の組織を描写することができます。この高感度かつ迅速なアッセイは、腎間の異常形態の異なる種類を実証する種々の変異体とモルファントに適用されています。腎間の3β-HSD活性は間腎組織の仕様はFf1b転写因子の特異的ノックダウンを介して破壊されると腎間の分化がFf1bの補調節因子PROX1 9,10のノックダウンによって影響されるように減少した胚には存在しません。特に、3β-HSD活性は、以下のような片目のピンヘッド 、重度の早期欠陥を有する変異体で検出することができ、どこ3β-H、 目を細めSD組織化学は、腎間の細胞遊走が11をどのように影響されるかを描きます。間腎組織の分化があっても、血液や血管系の完全な不存在下で損なわれることはありません。したがって、内皮由来の信号が整形方法を開発腎間の臓器は12,13を決定することができます。全体として、この組織化学的アッセイは、正常仕様、分化、およびゼブラフィッシュモデルにおけるステロイド産生細胞の遊走を研究するために使用されています。したがって、効率的かつ副腎および腎間の臓器障害をターゲットに任意の遺伝的または化学スクリーンのための信頼性の高いツールであるべきです。
Protocol
Representative Results
Discussion
3β-HSD活性の信号強度は、反応の過程にわたって増加しました。 3β-HSD活性のクリア信号が以降28 HPFからの段階のための反応の4時間後に検出されました。しかしながら、反応時間は、アッセイの目的に応じて、経験的な決意を必要とします。染色は一晩処理を必要とする場合には、わずかに青みがかった背景には、サンプル上で開発する傾向があります。この問題は、3β-HSDの活性染色の前に?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LI1及びTg（kdrl：EGFP）S843：私たちは、Tgは（GFP wt1b）を贈与するための教授クリストフEnglert教授ディディエStainierに感謝します それぞれの株、及びTg（kdrl：mCherryを）提供するための台湾ゼブラフィッシュ基盤施設ci5を 。この研究は102-、科学技術（96から2628-B-029から002-MY3、101から2313-B-029から001まで、102から2628-B-029から002-MY3の台湾省からの助成金によってサポートされていました2321-B-400から018）。
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
Referências
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
