JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

В Vitro модель для изучения клеточных трансформации, саркома Капоши герпеса

Published: August 25, 2017
doi:
10.3791/54828
, , , ,
1Division of Pediatric Infectious Diseases,University of Minnesota Medical School, 2Vaccine and Gene Therapy Institute,Oregon Health and Science University

Summary

Саркома Капоши (KS) представляет собой опухоль, вызванных инфекцией с онкогенный вирус герпеса человека герпеса-8/KS (HHV-8/KSHV). Описанная здесь модель культуры эндотелиальных клеток однозначно подходит для изучения механизмов, которыми KSHV трансформирует клетки хозяина.

Abstract

Саркома Капоши (KS) является необычным опухоли, состоящий из пролиферирующих клеток шпинделя, инициируется инфекции эндотелиальных клеток (EC) с KSHV и чаще всего развивается в параметре иммуносупрессии. Несмотря на десятилетия исследований оптимальное лечение KS остается плохо определены и клинические исходы, особенно неблагоприятных в условиях ограниченных ресурсов. KS поражения движет патологический ангиогенез, хроническое воспаление и онкогенеза, и были разработаны различные в пробирке клеток культуры модели для изучения этих процессов. KS возникает от KSHV-инфицированных клеток эндотелия происхождения, поэтому EC-линии клетки обеспечивают наиболее подходящим в vitro суррогаты шпинделя клеток прекурсора. Однако, потому что ЕС имеют срок действия ограниченной в пробирке , и как онкогенных механизмов, используемых KSHV менее эффективны, чем другие онкогенной вирусов, это было трудно оценить процессы трансформации в начальной или Теломераза увековечен EC. Таким образом, что легко поддерживает преобразование после инфекции с KSHV была разработана модель Роман культуры, основанной на ЕС. Эктопическая выражение генов E6 и E7 вирусом папилломы человека типа 16 позволяет расширенный культуры из соответствует возрасту и проход макета и KSHV инфицированных – EC и поддерживает развитие действительно превращается (т.е. онкогенной) фенотип в зараженных клеточных культур . Эта шансов справиться с возникающими и высокую воспроизводимость модель KS способствовало открытие нескольких основных сигнальных путей с высоким потенциалом для перевода на клинических параметров.

Introduction

Саркома Капоши (KS) является мульти фокуса angioproliferative опухоли, затрагивающих дермы, слизистых оболочек и висцеральных сайты, которые чаще всего развивается в условиях современных иммуносупрессия1. Были описаны четыре эпидемиологических формы: классика, праздного форма, которая обычно затрагивает пожилых людей наследия Средиземноморья и Ближнего Востока; Ятрогенные, приводя к от лечения с иммуносупрессивных препаратов, после трансплантации; эпидемия СПИДа определение рака; и эндемичные, ВИЧ независимые формы, часто встречается у детей в эндемичных регионах в Африке. С появлением эффективного сочетания схем антиретровирусного препарата для лечения ВИЧ эпидемии KS гораздо менее часто диагностируется в развивающихся странах. Однако клинически агрессивные формы эндемических и эпидемических остаются среди наиболее часто диагноз рака в многих африканских стран2,,3–4. Таким образом определение эффективных ориентированных на патогенез препаратов для лечения KS является приоритетом исследования.

Гистологически KS поражений характерны обширные но ненормальное неоваскуляризация, whereby шпинделя клетки ЕС происхождения формируют разрывными сосудистой сети5. Эти аномальные судов («сосудистые прорезями») позволяют экстравазации эритроцитов, которые дают поражения их характерный цвет. Кроме того поражения содержат многочисленные лейкоцитов, которые характеризуют хронического воспаления (т.е., лимфоцитов, макрофагов и плазматические клетки). Был описан регрессия новообразований KS, после восстановления иммунитета, предполагая, что KS имеет черты как гипер Пролиферативная поражения и истинный опухоли6,,78,9.

KS герпеса (KSHV), возбудителя KS, была определена в 1994 году10. С затем многие в vitro клеточной культуры модели были разработаны чтобы включить исследования патогенеза, включая клетки описаны от опухоли биопсийного материала и начальной или теломеразы выражая EC инфицированных KSHV в vitro11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18. ни одно из имеющихся в настоящее время модели полностью повторяет KS микроокружения опухоли, но все внесли ценные знания для нашего понимания pathobiology KSHV инфекции. В отличие от других известных онкогенной человеческого герпеса вирус Эпштейна – Барр (EBV), KSHV не легко превратить клетки в культуре, после de novo инфекции19,20,21, 22. Тем не менее, это ограничение было преодолено путем преобразования первичного человека ЕС либо смешанные микрососудистой или лимфатическую происхождения с E6 и E7 гены от вируса папилломы человека типа 16 до инфекции с KSHV23,24 . Выражение этих внешних онкогенов резко увеличивает преобразование потенциал KSHV в пробирке в части путем создания дополнительных ингибирование ретинобластомы белка и p5323,24. Этот метод трансдукции ЕС позволило несколько лабораторий для выявления ключевых изменений в принимающей ячейки экспрессии генов, вызванных KSHV инфекции и что, как представляется, облегчения KS ячейку выживания и распространения25,26 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32. протоколы, описанные здесь, являются простыми и высокую воспроизводимость и приведет к генерации соответствует возрасту и проход KSHV-инфицированных EC и инфицированных макет элементов управления, которые могут быть культивировали гораздо дольше, чем первичные элементы и будет возможность для расследования онкогенных механизмов, используемых KSHV. Хотя протокол включает метод для производства дикого типа KSHV от первичного выпота Лимфома клетки линии BCBL-1, Е6, Е7 увековечено EC также очень восприимчивы к инфекции с рекомбинантным BACmid производные KSHV-BAC1630. Протоколы для приготовления BAC16 описаны в других местах33,34.

Protocol

Примечание: все процедуры, описанные в настоящем протоколе должны выполняться в условиях BSL-2. 1. Подготовка KSHV фондовая подготовить TNE буфера: распустить 292.24 мг ЭДТА в ddH 2 O, довести до 225 мл и приспособиться к рН 8. Растворяют 605.7 мг трис ddH 2 O, довести до 225 мл …

Representative Results

Морфология первичных EC классически описал как «булыжник камень», и этот морфология не изменено выражением папилломы E6 и E7 генов (рис. 1A). Экспрессии генов E6 и E7, только не побудить преобразованной фенотип; Таким образом клетки подвержены связаться торможение и…

Discussion

Онкогенеза это многоэтапный процесс, который обходит важные гарантии внутри организма36. Как KS поражений существуют вдоль спектра хронического воспаления в истинной саркомы, разъяснение некоторых патофизиологических процессов при посредничестве KSHV требует провести нек?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана на HD068322 K12 (SCM); R01 CA179921 и P51 OD011092 (АВМ); и награда 14PRE20320014 из Америки ассоциации сердца (SB).

Materials

BCBL-1 cells NIH AIDS Reagent Program 3233
PA317 cells ATCC CRL-2203
Neonatal dermal microvascular endothelial cells Lonza CC-2505
EBM-2 Basal Medium Lonza CC-3156
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162
anti-KSHV LANA/ORF 73 Advanced Biotechnologies 13-210-100
TrypLETMExpress, no phenol red ThermoFisher 12604013
RPMI
DMEM
PBS with calcium and magnesium
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Bhutani, M., Polizzotto, M. N., Uldrick, T. S., Yarchoan, R. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus-associated malignancies: epidemiology, pathogenesis, and advances in treatment. Sem. Onc. 42 (2), 223-246 (2015).
  2. Dedicoat, M., Vaithilingum, M., Newton, R. Treatment of Kaposi’s sarcoma in HIV-1 infected individuals with emphasis on resource poor settings. The Cochrane database. (3), CD003256 (2003).
  3. Robey, R. C., Bower, M. Facing up to the ongoing challenge of Kaposi’s sarcoma. Curr. Op. Inf. Dis. 28 (1), 31-40 (2015).
  4. Sasco, A. J., et al. The challenge of AIDS-related malignancies in sub-Saharan Africa. PLOS ONE. 5 (1), e8621 (2010).
  5. Grayson, W., Pantanowitz, L. Histological variants of cutaneous Kaposi sarcoma. Diag. Path. 3, 31 (2008).
  6. Cattelan, A. M., et al. Regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma following antiretroviral therapy with protease inhibitors: biological correlates of clinical outcome. Euro. J. Can. 35 (13), 1809-1815 (1999).
  7. Yuan, D., et al. Use of X-Chromosome Inactivation Pattern to Analyze the Clonality of 14. Female Cases of Kaposi Sarcoma. Med. Sci. Mon. Bas. Res. 21, 116-122 (2015).
  8. Gill, P. S., et al. Evidence for multiclonality in multicentric Kaposi’s sarcoma. PNAS. 95 (14), 8257-8261 (1998).
  9. Douglas, J. L., Gustin, J. K., Moses, A. V., Dezube, B. J., Pantanowitz, L. Kaposi Sarcoma Pathogenesis: A Triad of Viral Infection, Oncogenesis and Chronic Inflammation. Trans. Biomed. 1 (2), (2010).
  10. Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266 (5192), 1865-1869 (1994).
  11. Moses, A. In vitro endothelial cell systems to study Kaposi sarcoma. Kaposi Sarcoma: A Model of Oncogenesis. (Chapter 4), (2010).
  12. McAllister, S. C., Moses, A. V. Endothelial Cell- and Lymphocyte-Based In Vitro Systems for Understanding KSHV Biology. Kaposi Sarcoma Herpesvirus: New Perspectives. 312 (Chapter 8), 211-244 (2007).
  13. Lagunoff, M., et al. De Novo Infection and Serial Transmission of Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus in Cultured Endothelial Cells. J. Virol. 76 (5), 2440-2448 (2002).
  14. Benelli, R., Repetto, L., Carlone, S., Parravicini, C. Establishment and characterization of two new Kaposi’s sarcoma cell cultures from an AIDS and a non-AIDS patient. Res. Virol. 145, 251-259 (1994).
  15. Simonart, T., et al. Iron as a potential co-factor in the pathogenesis of Kaposi’s sarcoma?. Int. J. Can. 78 (6), 720-726 (1998).
  16. An, F. Q., et al. Long-Term-Infected Telomerase-Immortalized Endothelial Cells: a Model for Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency In Vitro and In Vivo. J. Virol. 80 (10), 4833-4846 (2006).
  17. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  18. Lunardi-lskandar, Y., et al. Tumorigenesis and metastasis of neoplastic Kaposi’s sarcoma cell line in immunodeficient mice blocked by a human pregnancy hormone. Nature. 375 (6526), 64-68 (1995).
  19. Cesarman, E. Gammaherpesvirus and lymphoproliferative disorders in immunocompromised patients. Can. Let. 305 (2), 163-174 (2011).
  20. Jones, T., et al. Direct and efficient cellular transformation of primary rat mesenchymal precursor cells by KSHV. J. Clin. Inves. 122 (3), 1076-1081 (2012).
  21. Aguirre, A. J., Robertson, E. S. Epstein-Barr Virus Recombinants from BC-1 and BC-2 Can Immortalize Human Primary B Lymphocytes with Different Levels of Efficiency and in the Absence of Coinfection by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 74 (2), 735-743 (2000).
  22. Flore, O., et al. Transformation of primary human endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Nature. 394 (6693), 588-592 (1998).
  23. Moses, A. V., et al. Long-term infection and transformation of dermal microvascular endothelial cells by human herpesvirus 8. J. Virol. 73 (8), 6892-6902 (1999).
  24. Halbert, C. L., Demers, G. W., Galloway, D. A. The E7 gene of human papillomavirus type 16 is sufficient for immortalization of human epithelial cells. J. Virol. 65 (1), 473-478 (1991).
  25. Moses, A. V., et al. Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus-Induced Upregulation of the c-kit Proto-Oncogene, as Identified by Gene Expression Profiling, Is Essential for the Transformation of Endothelial Cells. J. Virol. 76 (16), 8383-8399 (2002).
  26. McAllister, S. C., et al. Kaposi sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) induces heme oxygenase-1 expression and activity in KSHV-infected endothelial cells. Blood. 103 (9), 3465-3473 (2004).
  27. Raggo, C., et al. Novel cellular genes essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Can. Res. 65 (12), 5084-5095 (2005).
  28. McAllister, S. C., Hanson, R. S., Manion, R. D. Propranolol Decreases Proliferation of Endothelial Cells Transformed by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus and Induces Lytic Viral Gene Expression. J. Virol. 89 (21), 11144-11149 (2015).
  29. Rose, P. P., Bogyo, M., Moses, A. V., Früh, K. Insulin-like growth factor II receptor-mediated intracellular retention of cathepsin B is essential for transformation of endothelial cells by Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. J. Virol. 81 (15), 8050-8062 (2007).
  30. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  31. Mansouri, M. Kaposi sarcoma herpesvirus K5 removes CD31/PECAM from endothelial cells. Blood. 108 (6), 1932-1940 (2006).
  32. Mansouri, M., Rose, P. P., Moses, A. V., Fruh, K. Remodeling of Endothelial Adherens Junctions by Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 82 (19), 9615-9628 (2008).
  33. Brulois, K. F., et al. Construction and manipulation of a new Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus bacterial artificial chromosome clone. J. Virol. 86 (18), 9708-9720 (2012).
  34. Myoung, J., Ganem, D. Generation of a doxycycline-inducible KSHV producer cell line of endothelial origin: Maintenance of tight latency with efficient reactivation upon induction. J. Virol. Meth. 174 (1-2), 12-21 (2011).
  35. Prudhomme, J. G., Sherman, I. W., Land, K. M. Studies of Plasmodium falciparum cytoadherence using immortalized human brain capillary endothelial cells. Int. J. Parasit. 26 (6), 647-655 (1996).
  36. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  37. Walker, L. R., Hussein, H. A. M., Akula, S. M. Disintegrin-like domain of glycoprotein B regulates Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus infection of cells. J. Gen. Virol. 95 (Pt 8), 1770-1782 (2014).
  38. Dai, L., et al. Sphingosine Kinase-2 Maintains Viral Latency and Survival for KSHV-Infected Endothelial Cells. PLOS ONE. 9 (7), e102314-e102319 (2014).
  39. Yoo, J., et al. Opposing Regulation of PROX1 by Interleukin-3 Receptor and NOTCH Directs Differential Host Cell Fate Reprogramming by Kaposi Sarcoma Herpes Virus. PLoS Path. 8 (6), e1002770 (2012).
  40. Sharma-Walia, N., et al. COX-2/PGE2: molecular ambassadors of Kaposi’s sarcoma-associated herpes virus oncoprotein-v-FLIP. Oncogenesis. 1 (4), e5 (2012).
  41. Dimaio, T. A., Gutierrez, K. D., Lagunoff, M. Latent KSHV Infection of Endothelial Cells Induces Integrin Beta3 to Activate Angiogenic Phenotypes. PLoS Path. 7 (12), e1002424 (2011).
  42. Wu, Y. H., et al. The manipulation of miRNA-gene regulatory networks by KSHV induces endothelial cell motility. Blood. 118 (10), 2896-2905 (2011).
  43. Alcendor, D. J., Knobel, S., Desai, P., Zhu, W. Q., Hayward, G. S. KSHV Regulation of Fibulin-2 in Kaposi’s Sarcoma: implications for tumorigenesis. Am. J. Path. 179 (3), 1443-1454 (2011).
  44. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  45. Toth, Z., et al. Epigenetic Analysis of KSHV Latent and Lytic Genomes. PLoS Path. 6 (7), e1001013 (2010).
  46. Damania, B., et al. Comparison of the Rta/Orf50 transactivator proteins of gamma-2-herpesviruses. J. Virol. 78 (10), 5491-5499 (2004).
  47. Koon, H. B., et al. Phase II trial of imatinib in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma: AIDS Malignancy Consortium Protocol 042. J. Clin. Onc. 32 (5), 402-408 (2014).
  48. Koon, H. B., et al. Imatinib-induced regression of AIDS-related Kaposi’s sarcoma. J. Clin. Onc. 23 (5), 982-989 (2005).
  49. Cao, W., et al. Imatinib for highly chemoresistant Kaposi sarcoma in a patient with long-term HIV control: a case report and literature review. Cur. Onc. 22 (5), 395 (2015).
  50. Botto, S., Totonchy, J. E., Gustin, J. K., Moses, A. V. Kaposi Sarcoma Herpesvirus Induces HO-1 during De Novo Infection of Endothelial Cells via Viral miRNA-Dependent and -Independent Mechanisms. mBio. 6 (3), e00668 (2015).
  51. Pantanowitz, L., et al. C-Kit (CD117) expression in AIDS-related, classic, and African endemic Kaposi sarcoma. App. Imm. & Mol. Morph. 13 (2), 162-166 (2005).
  52. Poole, L. J., et al. Altered Patterns of Cellular Gene Expression in Dermal Microvascular Endothelial Cells Infected with Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus. J. Virol. 76 (7), 3395-3420 (2002).
  53. Desnoyer, A., et al. Expression pattern of the CXCL12/CXCR4-CXCR7 trio in Kaposi sarcoma skin lesions. Brit. J. Derm. , 1-12 (2016).
  54. Dai, L., et al. Role of heme oxygenase-1 in the pathogenesis and tumorigenicity of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus. Oncotarget. 7 (9), 10459-10471 (2016).
  55. Chisholm, K. M., et al. β-Adrenergic receptor expression in vascular tumors. Modern Pathology. 25 (11), 1446-1451 (2012).
  56. Gerber, H. P., et al. Vascular endothelial growth factor regulates endothelial cell survival through the phosphatidylinositol 3′-kinase/Akt signal transduction pathway. Requirement for Flk-1/KDR activation. J. Biol. Chem. 273 (46), 30336-30343 (1998).
  57. Billstrom Schroeder, ., Christensen, M. R., Worthen, G. S. Human cytomegalovirus protects endothelial cells from apoptosis induced by growth factor withdrawal. J. Clin. Virol. 25 (Suppl 2), S149-S157 (2002).

Tags

In Vitro ModelCellular TransformationKaposi Sarcoma HerpesvirusKSHVEndothelial CellsMalignant TransformationViral OncogenesisKaposi SarcomaPathological AngiogenesisBCBL-1 CellsPMAViral Particle IsolationUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
McAllister, S. C., Hanson, R. S., Grissom, K. N., Botto, S., Moses, A. V. An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus. J. Vis. Exp. (126), e54828, doi:10.3791/54828 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image