Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
模式生物的系统性突变集合的表型特征是细胞解剖复杂一个行之有效的方法。单倍体单细胞绿藻莱茵衣藻具有类似植物的基因组,但它会从陆地上的植物前的土地厂房血统2多个基因组复制分歧。在原则上,缺乏基因复制和一个主要单倍体生命周期大大方便失功能遗传方法。然而,感兴趣的基因的靶向破坏几乎是不可能的,由于缺乏有效的同源基因组的整合。随机插入中断库正在建设中,结合打乱现场鉴定,到目前为止产生的阵列组代表1562个基因3 1,935映射中断。但是,这种方法(预期一般产生无效突变)并不适用于必需基因。温度敏感(TS)的突变可以recovered在必需基因,以及最近的方法允许突变基因和致病病变的有效识别。在高温下的表型分析,然后提供关于突变基因的功能即时信息。我们报道了在衣 〜70必需基因TS致死突变的分离和表征,特别是着眼于参与细胞周期进展的基因和控制1,4。
TS致命的屏幕已经遗传分析的支柱微生物几十年5,6。原则上,一个期望的特征是接近“饱和”,这意味着能够突变至TS杀伤力的所有基因通过至少一个突变鉴定,允许一个完整的分析。然而,在实践中,有几个因素限制了方法来饱和。首先,虽然几乎所有的基因可以被突变,以在高温下活性的损失,这种突变体的回收效率至少上变化7,8级的顺序。因此,随机屏幕开始回升复发安打饱和度接近很久以前“常客”。其次,虽然TS突变通常导致减少的功能,他们可能不以限制性的温度真空值(而相反地,常常没有充分发挥作用以允许温度)。这个问题可以通过比较多个等位基因处理到一定程度;如果它们都有一个共同的表型,这是更可能反映基因的简单失活的结果。多重等位基因也是致病病变1确切分子鉴定非常有帮助。然而,“常客”的问题意味着很少打基因复等位基因可能难以恢复。
由于这些原因,我们一直在开发一种增强管线来分离和表型表征TS突变体。我们收集了超过3000 TS突变体到目前为止,我ncluding约200新的候选细胞周期突变。这个集合,它可能已经包含大多数或所有细胞的必需途径突变的分子和表型分析应提供在植物细胞生物学新的见解和假设。重要的是,这条管道可以应用于生长在琼脂上以有效地构造TS突变体集合的任何微生物。
在设备上的说明:两个机器人是在此过程中(殖民地选择器和组合副本镀覆/樱桃采摘)的效率非常重要。采摘通常有金属针。挑菌落保持在空气中对这些引脚一段时间(数秒至数分钟,视型号而定)。衣死在约20秒在空气中的金属引脚上。这限制模式选择有机体。精度问题。我们的殖民地选择器是相当准确;但是,它是在它的动作有所暴力并且具有用于基于喷雾交叉污染一些可能性。它不是在高使用尔比384密度(4.5毫米中心 – 中心间距);在此密度,精度是完全可以接受的。副本电镀/樱桃采摘机器人(用于这些应用不同的附件)是采摘慢得多,但是对于1536密度足够准确的(6,144是一个挑战,即使是这种非常准确机器人;我们已评估了此密度,但决定不使用它,因为它的各种困难)。如果板装载不均匀等机器人将不能很好地工作。以抽查,以确保正确的事情正在发生是很重要的;当然,机器人会自动运行,并在一般情况下,一切都会顺利,如果前几个板块是正确的。
这里描述为TS致死突变高产隔离管道确保想必衣藻基因组的所有蜂窝必要的途径来表示。潜在的细胞周期基因的高效收集和消除重复的“常客”等位基因的两个最关键的步骤是:不完整的细胞周期; 2)对已确定的并行互补法逮捕表型特征1)相干定义查询基因放大与新分离出的那些集合。
当明暗周期同步,衣长在白天和单元尺寸> 10倍的增加光合没有任何DNA复制和细胞分裂13。夜间发作大致一致,将细胞再经历交替DNA复制,有丝分裂和细胞分裂( 图8)的多次循环。这种监管舍姆E提供主要需要用于细胞生长和完整性以及专门为细胞分裂周期所需的基因的基因之间的自然区分。我们发现,在10小时和20小时的时间点是非常丰富的用于初始粗糙表型切1。我们目前认识到TS致死突变,基于这些图像的大类(见SI的图林和跨,2014年)1,分别是:缺口,爆米花,圆形,小,中,早期的裂解和多周期( 图8 )。
三个最相关的类别,我们重点关注的缺口,爆米花,而圆。的“缺口”和“爆米花”表型以前证明是最细胞周期特异性的病变的特征( 例如,有丝分裂细胞周期蛋白依赖性激酶,DNA复制机械,和拓扑异构酶II)的1。一(缺口)或多个(爆米花)早期,但不成功的细胞分裂的视面的外观是一个方便的吗啉细胞周期起始ogical指标。这些突变体通常表现出很少或没有生长缺陷,并在在10小时标记类似于WT细胞体积增大。该Notch和爆米花的表型是在10小时明显和充分开发(常与细胞裂解有关)20小时。 “圆”类似的细胞长到WT但备受产量减少明显的初始分割平面,从而产生大而圆被捕细胞。此类别中以前突变落入为微管功能(微管蛋白折叠辅助因子,γ-微管蛋白环络合物)1所需的后期促进复合物14或在基因的组件。在稍后的时间,这些细胞经常表现出明显的细胞溶解。
“小”和“中”细胞的生长或者可以忽略不计(小)或显著小于WT(中)。许多这些突变体确定日期的有在基因,其注释表明在基本cellula角色病变- [R生长过程(翻译或膜生物合成)。中型和圆之间的主要微观歧视依赖于量的增长在10小时(回合:像WT;介质:减少)。由于中小企业的类别非常大,可能反映在一个伟大的范围内细胞通路的病变,我们并不试图饱和这些类别;但是,我们希望分子标识类的代表,了解损失的表型多样化的途径。两个研究忽略类别是:1)早期裂解,通过10小时的标记失去完整性(损失绿色的,refractility的损失),与现有的细胞生长的迹象和2)的多次循环的突变体。细胞增殖同样在10和20小时,WT,尽管它们表现出完全不能进行长期增殖。
我们大多表征“缺口”,“爆米花”和“圆”和排除中小型圆形细胞,以及因为漏水突变体完整的少数细胞分裂。这主要是保证基本细胞功能,如生长及膜的完整性,是功能性和富集分裂相关基因的概率。这种方法被发现是凭经验高效;但是,它可能是一个细胞周期的基因多效性的是,具有早些时候在G1其他角色,之前的实际分工。这种情况下,我们预计是罕见的,被错过。更一般地,我们的目标是同质逮捕,这在高概率是由于一个致病突变是一个完全不正常的蛋白质。然而,对于如刚刚所描述的相同的原因,可能有几种停滞点,因此,一定程度的灵活性是在选择候选为宜。
为了丰富与新发现的基因集合,所选择的候选人测定互补。我们要求TS-在阳性对照阴性对照(针对查询突变查询)和TS +(曲儿Ÿ对WT)。同一互补组的查询在新突变体是TS-。会员在同一互补组中几乎无一例外地反映了相同基因的分子损伤(这一直是我们测试过每一个这样的基因的情况下)。因此,对于“空中飞人”,这个标准是排除作进一步鉴定。这还以相同的互补基团为试查询突变体是新的基因的候选并通过生物信息学和实验工具被进一步表征。 TS-等位基因为不同互补群的高度可变的恢复是一个众所周知的现象,也就是说,变化是明显高于泊松噪声较大,由于可变性不同基因之间TS-的巨大内在的变异。原因可能包括内在热敏性差异;不同的蛋白质大小;的蛋白质的存在,作为一个单体与作为大的,稳定的复合物;和致突变热点。这几乎是一个纯nuisaNCE。然而,一个所得有利的结果是,“飞行常客”名单不长(只有几个目标占据了大部分的列表),所以劳动密集型互补测试不是一个艰巨的任务,直到项目的后期阶段。
作为一个补充的方法,我们进行了联动试验。在该测定中,抗双后代被选择并且用于TS-表型进行测试。一个TS-型预期(和观察)相同互补组在突变体作为查询或紧密连锁的突变。对于每个被测试的基因中,WT子代预计出现(TS +表型)中以一定的概率取决于遗传距离。我们估计,大约有100接合孢子在这些斑点每个交配。假设100%减数分裂效率,这将导致从取消关联药物抗性盒大约100双药物抗性后代(减数分裂后代的25%,四每减数分裂,由于至Mendelian继承)。这也将是TS-突变,其中所述后代的25%将是双突变的情况下,与25%将是WT,如果查询和测试的突变是无关联。因此,出了双药物抗性子代,25%将是WT(约25个细胞)。这是完全无关联突变的情况;然而,中度连锁(约20厘米,约2兆,或基因组115的2%以内)将强有力地减少或消除的TS +信号用。在被测试的突变的联系的对抗生素盒的情况下,即是双药物抗性TS +单倍体存在于非常低量。这表现为明显的故障与测试的所有突变体重组,尽管所有的补充测试的突变体,异常的结果,很容易注意;在这种情况下,回交将解决这个问题。
无论从先前的知识和序列分析,我们预计在衣藻细胞周期基因是大约500个基因2,虽然莫ST,但可能不是全部,是必不可少的。我们将评估为更多的突变体收集额外诱变轮的必要性和饱和升高的水平。
这个过程的独特设计用于研究基本生物过程和实施它们的基因和蛋白质。其他方法来产生必需基因扰动存在( 例如,随机诱变的等位基因16,有条件地转录等位基因17,或亚效等位基因等位基因18的变换)。然而,它们都需要同源重组,其在营养衣强烈抑制。群集,定期相互间隔短回文重复(CRISPR)/ Cas9系统已经被确立为基因修饰19的有力工具;但是,它是尚未在衣20有效地工作。关键的是,所有这些方法要求目标的先验知识。这是一个严重的限制如果希望有学习新东西的可能性!我们的做法会产生突变鉴定必需基因,独立于任何先验知识。因此,在技术的现有水平,随机TS突变随后通过深度测序基因鉴定的隔离可能是获得快速进入微生物细胞生物学在植物superkingdom的最有效的方法。
致病突变的鉴定(选自〜100的编码序列变化的突变每个克隆)是超出了本文的范围。分群池1的深度测序是有效的,但劳动密集型的。一种用于在大量的菌株的所有突变的一种测定组合池策略,测序少数池后,是非常成本和劳动高效。对于组合分群测序的新战略正在开发中,将允许致病突变的鉴定几十个突变体的SIM卡ultaneously单个测序运行(筹备中)。这些效率是非常重要的,以允许关键基因鉴定的步骤,以保持与由此处描述的过程成为可能的突变体的非常迅速积累速度。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢意见和有益的讨论十字架实验室成员。这项工作是由PHS 5RO1-GM078153和支持 从西蒙斯基金会米哈尔Breker的一个初级研究员奖。
Equipment: | |||
Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |