Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Traditionelle Maßnahmen der intrazellulären antimikrobielle Aktivität und eukaryotische Zelle Zytotoxizität vertrauen auf Endpunkt-Assays. Solche Endpunktassays erfordern mehrere zusätzliche experimentelle Schritte vor, wie Zelllyse auszulesen, koloniebildende Einheit Bestimmung oder Reagenzzugabe. Wenn Tausende von Assays, beispielsweise während des Hochdurchsatz-Screening durchgeführt wird, die stromabwärts Aufwand für diese Arten von Assays erforderlich ist, ist beträchtlich. Daher Hochdurchsatz antimikrobielle Entdeckung zu erleichtern, haben wir ein Echtzeit-Test, um gleichzeitig Inhibitoren der intrazellulären Bakterienwachstums identifizieren und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität zu bewerten. Insbesondere wurde das Bakterienwachstum intrazellulärem Echtzeit – Detektion von Markierungs bakterielle Screening Stämme aktiviert entweder mit einem bakteriellen lux – Operon ^(1. Generation assay) oder fluoreszierendes Protein Reporter (2 ^nd Generation, orthogonal assay). Eine nicht-toxische, Zellmembran-impermeante, nukleinsäurebindende Farbstoffwurde auch während der anfänglichen Infektion von Makrophagen aufgenommen. Diese Farbstoffe werden aus lebenden Zellen ausgeschlossen. Allerdings nicht lebensfähigen Wirtszellen verlieren die Integrität der Membran erlauben Eintritt und Fluoreszenzmarkierung von Kern-DNA (Desoxyribonukleinsäure). Bemerkenswerterweise ist DNA-Bindung mit einer starken Zunahme der Fluoreszenzquantenausbeute verbunden, die eine lösungsbasierte Auslesen der Wirtszelle Tod liefert. Wir haben dieses kombinierten Assay verwendet ein Hochdurchsatz-Bildschirm in Mikroplattenformat durchzuführen, und die intrazelluläre Wachstum und die Zytotoxizität durch Mikroskopie zu bewerten. Bemerkenswerterweise zeigen können antimikrobielle Mittel Synergie in denen die kombinierte Wirkung von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln, wenn sie zusammen angewendet ist größer als bei getrennter Anwendung. Die Prüfung auf in vitro Synergie gegen intrazelluläre Erreger ist in der Regel eine ungeheure Aufgabe als kombinatorische Permutationen von Antibiotika in verschiedenen Konzentrationen zu beurteilen ist. Allerdings fanden wir, dass unsere Echtzeit-Test kombiniert mit automatisierten, digitalen Dosiertechnik pfacile Synergie Test ermitted. Mit diesen Ansätzen konnten wir systematisch Wirkung einer großen Anzahl von antimikrobiellen Mitteln vermessen allein und in Kombination gegen das intrazelluläre Pathogen Legionella pneumophila.

Introduction

Pathogene, die wachsen oder sich dort aufhalten vorübergehend in intrazellulären Kompartimenten sind schwer zu therapeutisch auszurotten. Obligat oder relativ intrazelluläre Erreger obligat wie Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, spp Brucella. , Francisella tularensis und Mycobacterium spp. erfordern oft Kurse der antimikrobiellen Therapie zur Heilung verlängert, die von Monaten sogar Jahre reichen. Darüber hinaus können extrazelluläre Erreger transient intrazellulären Nischen besetzen und auf diese Weise der Freigabe durch normalen Kurse der antimikrobiellen Therapie entkommen und später entstehen neue Runden von virulenten Infektion zu starten. Staphylococcus aureus ¹ und uropathogene Enterobacteriaceae ^2,3 – Infektionen sind zwei Beispiele zunehmend erkannt. Daher ist eine grundlegende Drug Discovery Ziel Roman antimikrobielle Substanzen zu identifizieren, die in intrazelluläre Kompartimente eindringen. Optimale Therapie, um schnell zu beseitigenintrazelluläre Organismen und Entwicklung von Resistenzen durch subinhibitorischen antimikrobielle Exposition verhindern, ist besonders erwünscht.

Zu diesem Zweck haben wir ein Hochdurchsatz – Screening – Technologie zu intrazellulärem-penetrierenden antimikrobielle Mittel die intrazelluläre Wachstum des Modells pathogen Targeting, Legionellen pneumophila identifizieren. ⁴ Bisherige klinische Beobachtungen zeigen , dass Standard antimikrobielle Empfindlichkeitsprüfung nicht genau in vivo therapeutische Wirksamkeit gegen diesen Organismus vorhersagen. Spezifisch ⁵ war dies wegen Hauptklassen von antimikrobiellen Mitteln wie β-Lactame und Aminoglykoside, obwohl hochwirksam gegen axenisch gewachsen Legionellen, nicht ausreichend nicht in die intrazellulären Kompartimente eindringen , wo Legionellen befindet. ^5,6 Später Beweise vorgeschlagen , dass technisch komplexer intrazellulären Wachstumstests effektiv klinische Wirksamkeit vorhergesagt. ⁷ </sup> Leider waren diese Assays extrem mühselige Endpunkte Assays infizierten Makrophagen erfordern, mit antimikrobiellen Mitteln behandelt, zu verschiedenen Zeiten Punkte für koloniebildende Einheit Enumeration lysiert werden. Solche Tests sind unpraktisch in großem Maßstab zu tun und für Hochdurchsatz-Wirkstoffforschung ungeeignet sind.

Daher entwickelten wir Technologie für Echtzeit-Bestimmung der intrazellulären Bakterienwachstum. ⁶ Dies wurde durch die Verwendung eines Bakterienstammes erreicht modifiziert durch Integration von entweder einer bakteriellen Luciferase – Operon ⁸ (erste Generation Assay zuvor beschrieben) ⁴ oder fluoreszierendes Protein ⁹ Reporter (zweite Generation, orthogonal Assays hier beschrieben) in das Bakterienchromosom. Auf diese Weise Lumineszenz- oder Fluoreszenzsignal liefert ein Surrogat, Echtzeit-Auslesen von Bakterienzahl.

Allerdings sind diese Attribute nicht einen großen Störfaktor bei der intrazellulären infectio Adressen-Assays, Off-Target-Effekte auf Wirtszellen. Insbesondere begrenzt der Tod der Wirtszelle von Natur aus intrazellulären Wachstum und führt zu falschen positiven Identifizierung der antimikrobiellen Wirkung. Wie viele Verbindungen in Screening-Bibliotheken sind eukaryotische Zelle toxisch, so Fehlalarme wahr antimikrobielle Substanzen überwältigen würde, eine große Anzahl von Follow-up, Endpunkt Cytotoxizitätsassays für die Auflösung erforderlich macht.

So war es von großem Interesse eukaryotische Zelllebensfähigkeit zu bewerten zu können und das intrazelluläre Wachstum gleichzeitig. Bemerkenswert ist, ein Merkmal der nicht lebensfähigen eukaryontischen Zellen ist der Verlust der Zellmembranintegrität. Sonden, die die Durchlässigkeit der Zellmembran testen kann daher verwendet werden, die Lebensfähigkeit der Zellen zu untersuchen. Wir gekennzeichnet zuvor die Fähigkeit einer Reihe von putativ Zellmembran-impermeante, fluoreszierende DNA-bindende Farbstoffe zuzugreifen und Kern-DNA von abgestorbenen Zellen färben. ⁴ Bei der Bindung Kern – DNA, diese Farbstoffe eine starke Zunahme der Quantu anzeigenm Fluoreszenzausbeute was zu einer erhöhten Signal gegenüber dem Hintergrund Lösung Fluoreszenz. Als solche, sofern diese Farbstoffe eine quantitative Anzeige der eukaryotischen Zelltod. Bemerkenswerter ^4, fanden wir , dass mehrere waren nicht toxisch selbst während längerer Koinkubation mit J774 Makrophagen. Wenn während der Erstinfektion hinzugefügt, sofern sie eine Echtzeit-Fluoreszenz-Anzeige von eukaryotischen Zelltod, die mikroskopisch durch eine Mikrotiterplatte oder Fluorimeter beobachtet gemessen werden kann.

Daher ist es durch Verwendung eines bakteriellen Reporter kombiniert und ungiftig, Membran-impermeablen, DNA-bindende Farbstoffe, waren wir in der Lage, ein einfaches, zerstörungsfrei, Echtzeit-Assay sowohl bakterielle Belastung und eukaryotischen Zell-Cytotoxizität gleichzeitig zu messen zu entwickeln. Dieser Assay hat uns in 384-Well-Plattenformat ~ 10.000 bekannt bioactives einschließlich ~ 250 antimikrobiellen Mitteln und> 240.000 kleine Moleküle mit funktionell nicht charakterisierten Aktivität auf die Fähigkeit zur Hemmung der intrazellulären Wachstum zu screenen erlaubtLegionella pneumophila, während zur gleichen Zeit für jede Verbindung eukaryotischen Zell – Cytotoxizität Daten. ⁶ Unsere Analyse bekannter antimikrobieller Mittel gegen intrazelluläre Wachstum von Legionellen war die umfassendste Untersuchung dieser Art bisher. ⁶

Basierend auf der Effizienz unseres Testformats, erforschten wir auch anschließend die potenziell synergistische Wirkungen bekannter antimikrobieller Mittel, wenn sie in Kombination verwendet werden. Eine der häufigsten Synergietests, die so genannte Schachbrett Assay wird üblicherweise durch die Beurteilung der kombinatorischen Wirkung von zweifachen Reihenverdünnungen von zwei oder mehreren antimikrobiellen Mitteln durchgeführt. ¹⁰ In diesen Assays wird Synergie durch die Beobachtung von grßeren Effekt definiert , wenn zwei oder mehr antimikrobielle Mittel zusammen als die Summe der Wirkungen von jeweils separat aufgetragen angewendet werden. Zu beachten ist , konzentrierte sich bisher nur und selektive Synergie Test wurde gegen intrazelluläre Legionella pneumophila durchgeführt </em> wegen der großen Anstrengungen in der traditionellen Endpunkt-Assays durch die kombinatorische Permutationen erforderlich multipliziert beteiligt.

Um Synergie Prüfung zu erleichtern, haben wir den Einsatz unserer Echtzeit – intrazellulären Wachstum / eukaryotischen Zytotoxizitätstest in Kombination mit automatisierten digitalen Dosiertechnik ^6. Diese Automatisierung erlaubt uns serielle Verdünnungen der Verbindungen in DMSO oder wässriger Lösung allein oder in Kombination in 384-Well-Format gelöst zu verzichten. ¹¹ Darüber hinaus solche robuste Liquid – Handling – Technologie erlaubt uns leicht höhere Auflösung führen zu, Quadratwurzel von zwei Kindern ( und nicht als der Standard, mit geringerer Auflösung, Verdoppelung) Verdünnung Kombinationen zu einer höheren Spezifität in unserem zweidimensionalen erreichen, schachbrett Synergie Analyse. Diese Resolution war besonders wertvoll Bedenken in der Synergie Bereich über Reproduzierbarkeit Adressierung bei der Verwendung von zweifache Verdünnungsreihe ^12. Schließlich war unser Test quantitative und auch therefore Abstufungen der Hemmung gemessen. Als Ergebnis erfasst der Test für die Vollständigkeit der inhibitorischen Informationen exprimierbar in Isokontur Isobologramme in dem kombinatorischen Konzentrationen mit ähnlichen Mengen an Wachstumshemmung Isokonturen verbinden. ⁶ Diese Plotten Strategie erlaubt die Visualisierung von kombinatorischen Dosis-Wirkungs-Kurven. Um unsere Methodik zu illustrieren, beschreiben wir unser Protokoll dieser Assays für die Durchführung und repräsentative Ergebnisse.

Protocol

1. Echtzeit intrazelluläres Wachstum und eukaryotischen Zelle Zytotoxizitätstest Vorbereiten Wirtszellen (J774A.1 Zellen) Kultur J774A.1 Mus musculus Makrophagen-ähnlichen Zellen in Suspension in RPMI 1640 mit 9% Eisen ergänzt Kälberserum. Zunächst Passage in Zellkulturflaschen. Nachdem die Zellen konfluent in einem 75 cm 2 Gewebekulturkolben in 15 ml Medium geworden sind, geteilt durch Abkratzen und Verdünnen auf 65 ml mit dem gleichen Typ des Mediums, von denen 15 ml in d…

Representative Results

Microplate intracellular growth assay Figure 1 diagrams the assay steps. The automated steps shown can be performed manually. However, throughput is greatly facilitated using liquid handling systems. Figure 2 shows representative results from a 384-well microplate, dual-readout, real-time intracellular growth and eukaryotic cell cytoto…

Discussion

We describe real-time assays for simultaneous detection of intracellular bacterial growth and host cell cytotoxicity. There are several critical steps in the protocol. First, for robust assay performance, there must be sufficient spectral separation between bacterial and cytotoxicity readouts. Such separation is intrinsic for combinations of luciferase operon reporters and fluorescent DNA-binding dyes. However, based on our experience (Table 1-3, Figure 2), use of dual, fluorescent reado…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.