De alto rendimiento, en tiempo real, Prueba de doble lectura de Intracelular Actividad antimicrobiana y la citotoxicidad celular eucariótica

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Las medidas tradicionales de actividad antimicrobiana intracelular y la citotoxicidad de las células eucariotas se basan en ensayos de punto final. Dichos ensayos de punto final requieren varios pasos experimentales adicionales antes de lectura de salida, tales como la lisis celular, la determinación de unidades formadoras de colonias, o la adición del reactivo. Al realizar miles de ensayos, por ejemplo, durante el cribado de alto rendimiento, el esfuerzo aguas abajo requerida para este tipo de ensayos es considerable. Por lo tanto, para facilitar el descubrimiento antimicrobiano de alto rendimiento, hemos desarrollado un ensayo en tiempo real para identificar simultáneamente inhibidores de crecimiento bacteriano intracelular y evaluar la citotoxicidad de células eucariotas. En concreto, la detección de crecimiento bacteriano intracelular en tiempo real se ha habilitado mediante el marcado de las cepas bacterianas de cribado, ya sea con un operón lux bacteriana (1 ^st generación de ensayo) o reporteros de proteínas fluorescentes ^(2ª generación, ensayo ortogonal). A, célula membrana impermeable, tinte de unión a ácido nucleico no tóxicotambién se añadió durante la infección inicial de los macrófagos. Estos colorantes se excluyen de las células viables. Sin embargo, las células huésped no viables pierden integridad de la membrana que permite la entrada y etiquetado fluorescente de ADN nuclear (ácido desoxirribonucleico). En particular, el ADN de unión se asocia con un gran aumento en el rendimiento cuántico fluorescente que proporciona una lectura basada en la solución de la muerte de la célula huésped. Hemos utilizado este ensayo combinado para llevar a cabo una pantalla de alto rendimiento en formato de microplacas, y para evaluar el crecimiento intracelular y la citotoxicidad por microscopía. En particular, los agentes antimicrobianos pueden demostrar la sinergia en el que el efecto combinado de dos o más agentes antimicrobianos cuando se aplica juntos es mayor que cuando se aplica por separado. Las pruebas de sinergia in vitro frente a patógenos intracelulares es normalmente una tarea prodigiosa como permutaciones combinatorias de antibióticos en diferentes concentraciones deben ser evaluados. Sin embargo, encontramos que nuestro ensayo en tiempo real combinado con automatizado, dispensación tecnología digital permitted pruebas de sinergia fácil. El uso de estos enfoques, hemos sido capaces de examinar sistemáticamente la acción de un gran número de antimicrobianos solos y en combinación contra el patógeno intracelular, Legionella pneumophila.

Introduction

Los patógenos que crecen o residen temporalmente en compartimentos intracelulares son difíciles de erradicar terapéuticamente. Obligar o relativamente obligar a patógenos intracelulares tales como Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, y Mycobacterium spp. a menudo requieren ciclos de terapia antimicrobiana prolongada para la curación que puede variar de meses a incluso años. Además, los patógenos extracelulares pueden ocupar transitoriamente nichos intracelulares y de este modo escapar un despeje de cursos normales de terapia antimicrobiana y más tarde emerger para iniciar nuevas rondas de infección virulenta. Staphylococcus aureus ¹ y enterobacterias ^2,3 infecciones uropatogénicas son dos ejemplos cada vez más reconocidos. Por lo tanto, un objetivo fundamental el descubrimiento de fármacos es la identificación de nuevos agentes antimicrobianos que penetran en compartimentos intracelulares. El tratamiento óptimo para erradicar rápidamenteorganismos intracelulares y prevenir el desarrollo de resistencia a los antimicrobianos mediante la exposición sub-inhibidor es especialmente deseable.

Con este fin, hemos desarrollado una tecnología de selección de alto rendimiento para identificar agentes antimicrobianos intracelulares-penetrante de orientación el crecimiento intracelular del patógeno modelo, Legionella pneumophila. ⁴ observaciones clínicas anteriores indican que las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos estándar no predice con precisión in vivo la eficacia terapéutica contra este organismo. ⁵ En concreto, esto se debía a que las principales clases de antimicrobianos tales como beta-lactámicos y aminoglucósidos, aunque muy eficaz contra la Legionella axenically crecido, no tienen suficientemente penetran en los compartimentos intracelulares donde reside la Legionella. ^5,6 tarde, las pruebas sugiere que los ensayos de crecimiento intracelular técnicamente más complejas predijeron con eficacia la eficacia clínica. ⁷ </sup> Por desgracia, estos ensayos fueron variables ensayos extremadamente laborioso ya que los macrófagos infectados, tratados con antimicrobianos, que se sometieron a lisis en diferentes puntos Tiempos de unidades formadoras de colonias enumeración. Dichos ensayos son poco prácticos para hacerlo a gran escala y no son adecuados para el descubrimiento de fármacos de alto rendimiento.

Por lo tanto, hemos desarrollado la tecnología para la determinación en tiempo real de crecimiento bacteriano intracelular. ⁶ Esto se logró mediante el uso de una cepa bacteriana modificada a través de la integración de cualquiera de un bacteriana luciferasa operón ⁸ (ensayo de primera generación, que se describe anteriormente) ⁴ o fluorescente proteína ⁹ reporteros (segunda generación, de ensayo ortogonal, que se describe aquí) en el cromosoma bacteriano. De esta manera, luminiscente o señal fluorescente proporciona un sustituto, la lectura en tiempo real del número de bacterias.

Sin embargo, estos atributos no se refieren a un factor de confusión importante en INFECTIO intracelularn ensayos, fuera de objetivo efectos en las células huésped. En particular, la muerte de la célula huésped inherentemente limita el crecimiento intracelular y conduce a la identificación de falsos positivos del efecto antimicrobiano. Como muchos de los compuestos en las bibliotecas de cribado son células eucariotas tóxicos, tales falsos positivos abrumarían verdaderos agentes antimicrobianos, lo que exige un gran número de seguimiento, los ensayos de citotoxicidad punto final para la resolución.

Por lo tanto, era de gran interés para poder evaluar la viabilidad celular eucariota y el crecimiento intracelular de forma simultánea. En particular, una característica de las células eucariotas no viables es la pérdida de integridad de la membrana celular. Por lo tanto, las sondas que ponen a prueba la permeabilidad de la membrana de la célula se pueden usar para evaluar la viabilidad celular. Hemos caracterizado previamente la capacidad de una serie de células putativamente membrana no permeables, colorantes fluorescentes, unión al ADN para acceder y manchar el ADN nuclear de células muertas. ⁴ en el ADN nuclear de unión, estos tintes muestran un gran aumento en quantum rendimiento fluorescente resulta en una mayor señal a través de fluorescencia de la solución de fondo. Como tal, estos colorantes proporcionan una lectura cuantitativa de la muerte celular eucariota. ⁴ En particular, se encontró que varios eran ellos mismos no tóxico durante prolongado co-incubación con macrófagos J774. Cuando se añade durante la infección inicial, proporcionaron un tiempo real, la lectura fluorescente de la muerte celular eucariota que se puede medir por un fluorímetro de microplaca o observó microscópicamente.

Por lo tanto, mediante la combinación de uso de un reportero bacteriana y no tóxico, la membrana impermeable, colorantes de unión al ADN, que fueron capaces de desarrollar un método no destructivo, el ensayo simple, en tiempo real para medir tanto la carga bacteriana y la citotoxicidad de células eucariotas simultáneamente. Este ensayo ha permitido a la pantalla en 384 pocillos formato de placa de ~ 10.000 bioactivos conocidos incluyendo ~ 250 antimicrobianos y> 240.000 pequeñas moléculas con actividad funcionalmente no caracterizado por la capacidad de inhibir el crecimiento intracelular deLegionella pneumophila, mientras que al mismo tiempo la generación de datos de citotoxicidad de células eucariotas para cada compuesto. ⁶ Nuestro análisis de los antimicrobianos conocidos contra el crecimiento intracelular de Legionella fue la exploración más completa de este tipo hasta la fecha. ⁶

En base a la eficacia de nuestro formato de ensayo, también posteriormente explorado los efectos potencialmente sinérgicas de agentes antimicrobianos conocidos cuando se usan en combinación. Una de las pruebas de sinergia más comunes, el llamado ensayo de tablero de ajedrez, se realiza de manera estándar mediante la evaluación de los efectos combinatorios de diluciones en serie de dos veces de dos o más agentes antimicrobianos. ¹⁰ En estos ensayos, la sinergia se define por la observación de mayor efecto cuando dos o más agentes antimicrobianos se aplican conjuntamente que la suma de los efectos de cada aplicados por separado. Es de destacar que, hasta ahora, sólo se centra y pruebas de sinergia selectiva se llevó a cabo en contra intracelular de Legionella pneumophila </em> debido a la gran esfuerzo involucrado en ensayos de punto final tradicional multiplicada por las permutaciones necesarias combinatorias.

Para facilitar las pruebas de sinergia, hicimos uso de nuestro ensayo de citotoxicidad en tiempo real de crecimiento intracelular / eucariota en combinación con la tecnología digital de dispensación automatizada ^6. Esta automatización nos permitió prescindir de diluciones en serie de compuestos disueltos en DMSO o solución acuosa solo o en combinación en formato de 384 pocillos. ¹¹ Por otra parte, tales robusta tecnología de tratamiento de líquidos nos permitió realizar fácilmente una resolución más alta, la raíz cuadrada de dos niños (en lugar de la norma, de menor resolución, doblando) combinaciones de dilución para alcanzar mayores niveles de especificidad en nuestro bidimensional, la sinergia de tablero de ajedrez análisis. Esta resolución fue especialmente valiosa para abordar las preocupaciones en materia sinergia sobre la reproducibilidad cuando se utiliza una doble serie de dilución ^12. Por último, nuestro ensayo fue cuantitativa y también Therntes de gradaciones de inhibición medido. Como resultado, el ensayo capturó la totalidad de la información inhibitorio, expresable en isocontorno isobologramas en el que isocontours conectar concentraciones combinatorias con niveles similares de inhibición del crecimiento. ⁶ Esta estrategia trazado permitió la visualización de las curvas de dosis-respuesta combinatorias. Para ilustrar nuestra metodología, describimos nuestro protocolo para la realización de estos ensayos y mostrar los resultados representativos.

Protocol

El crecimiento intracelular 1. Tiempo Real y la célula eucariótica Ensayo de citotoxicidad Preparación de células huésped (células J774A.1) Células como los macrófagos-Cultura J774A.1 Mus musculus en suspensión en RPMI 1640 con suero de ternera suplementado con hierro 9%. Inicialmente pasaje en matraces de cultivo tisular. Después las células se han vuelto confluente en un 75 cm matraz de cultivo de 2 tejido en 15 ml de medio, dividido por raspado y la dilución a 65 ml…

Representative Results

ensayo de crecimiento intracelular de microplacas Figura 1 Diagrama de las etapas del ensayo. Los pasos automatizados que se muestran se pueden realizar manualmente. Sin embargo, el rendimiento se facilita en gran medida el uso de sistemas de manejo de líquidos. La Figura 2 muestra los resultados representativos de una microplaca d…

Discussion

Describimos ensayos en tiempo real para la detección simultánea del crecimiento bacteriano intracelular y la citotoxicidad de la célula huésped. Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, para robusto rendimiento del ensayo, debe haber suficiente separación espectral entre lecturas bacterianas y de citotoxicidad. Tal separación es intrínseco para las combinaciones de los reporteros operón luciferasa y tintes fluorescentes de unión al ADN. Sin embargo, basándonos en nuestra experiencia <strong…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.