Hög genomströmning, i realtid, med dubbla avläsning Provning av intracellulära antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Traditionella mått på intracellulär antimikrobiell aktivitet och eukaryot cell cytotoxicitet lita på endpoint analyser. Sådana endpoint analyser kräver flera ytterligare experimentella steg före avläsning, såsom cell-lys, kolonibildande enhet bestämning, eller tillsats av reagens. Vid utförande av tusentals analyser, till exempel under high-throughput screening, är den nedströms belägna ansträngning som krävs för dessa typer av analyser betydande. Därför att underlätta hög genomströmning antimikrobiell upptäckt, har vi utvecklat en realtidsanalys för att samtidigt identifiera hämmare av intracellulära bakterietillväxt och bedöma eukaryot cell cytotoxicitet. Specifikt realtid intracellulär bakterietillväxt detektering aktiveras genom att markera bakterie screening stammar med antingen en bakteriell lux-operonet (1 ^st generationen analys) eller fluorescerande protein reportrar ^{(2: a} generationens, ortogonala analys). En icke-toxisk, cellmembran impermeant, nukleinsyrabindande färgämnetillsattes också vid initial infektion av makrofager. Dessa färgämnen är uteslutna från levande celler. Men icke livsdugliga värdceller förlorar membranintegritet medger inträde och fluorescerande märkning av kärn-DNA (deoxiribonukleinsyra). Notably, DNA-bindning är förknippad med en stor ökning av fluorescerande kvantutbyte som ger en lösningsbaserad utläsning av värd celldöd. Vi har använt denna kombinerade analys för att utföra en hög genomströmning skärm i mikroformat, och för att bedöma intracellulära tillväxt och cytotoxicitet av mikroskopi. Anmärkningsvärt, kan antimikrobiella visar synergi där den kombinerade effekten av två eller flera antimikrobiella medel när de appliceras tillsammans är större än när det appliceras separat. Testning för in vitro synergi mot intracellulära patogener är normalt en ofantlig uppgift som kombinatoriska varianter av antibiotika vid olika koncentrationer skall bedömas. Vi fann emellertid att vår realtidsanalys i kombination med automatiserad, digital dispenseringsteknik permitted facile synergi testning. Med hjälp av dessa metoder, kunde vi systematiskt kartlägga inverkan av ett stort antal enbart antimikrobiella medel och i kombination mot den intracellulära patogenen, Legionella pneumophila.

Introduction

Patogener som växer eller uppe tillfälligt i intracellulära fack är svåra att terapeutiskt utrota. Förpliktigar eller förpliktigar relativt intracellulära patogener såsom Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, och Mycobacterium spp. ofta kräver långvarig kurser antimikrobiell behandling för botemedel som kan variera från månader till och med år. Dessutom kan extracellulära patogener gående ockupera intracellulära nischer och på så sätt undgå clearance av normala kurser antimikrobiell behandling och senare dyker starta nya omgångar av virulent infektion. Staphylococcus aureus ¹ och uropatogena Enterobacteriaceae ^2,3 infektioner är två alltmer erkända exempel. Därför är en grundläggande läkemedelsutveckling mål att identifiera nya antimikrobiella medel som tränger in i intracellulära fack. Optimal terapi för att snabbt utrotaintracellulära organismer och förhindra utveckling av resistens genom sub-hämmande antimikrobiella exponering är särskilt önskvärd.

För detta ändamål har vi utvecklat en high-throughput screening teknik för att identifiera intracellulära-penetrerande antimikrobiella medel som riktar sig till intracellulära tillväxten av modellen patogen, Legionella pneumophila. ⁴ Tidigare kliniska observationer tyder på att standarden resistensbestämning inte exakt hade förutsäga in vivo terapeutisk effekt mot denna organism. ⁵ Närmare bestämt var detta eftersom stora klasser av antimikrobiella medel såsom p-laktamer och aminoglykosider, men mycket effektiv mot axeniskt odlade Legionella, inte tillräckligt tränga in i intracellulära avdelningar där Legionella är bosatt. ^5,6 Senare bevis föreslog att tekniskt mer komplexa intracellulära tillväxtanalyser effektivt förutspått klinisk effekt. ⁷ </sup> Tyvärr är dessa analyser var extremt mödosamma endpoints analyser, kräver infekterade makrofager, som behandlats med antimikrobiella medel, som skall lyseras vid olika tidpunkter poäng för kolonibildande enhet uppräkning. Sådana analyser är opraktiskt att göra i stor skala och är olämpliga för high-throughput drug discovery.

Därför har vi utvecklat teknologi för realtids-bestämning av intracellulär bakterietillväxt. ⁶ Detta åstadkoms genom användning av en bakteriestam modifierad genom integration av antingen en bakteriell luciferas operon ⁸ (första generationen analysen tidigare beskrivits) ⁴ eller fluorescerande protein ⁹ reportrar (andra generationens, ortogonala analys, beskrivs här) i bakteriekromosomen. På detta sätt, självlysande eller fluorescerande signal ger ett surrogat realtid avläsning av bakteriell nummer.

Men dessa attribut inte upp en stor confounder i intracellulär infection analyser, off-target effekter på värdceller. I synnerhet död av värdcellen i sig begränsar intracellulär tillväxt och leder till falsk positiv identifiering av antimikrobiell effekt. Som många föreningar i screeningsbibliotek är eukaryota celler giftiga sådana falska positiva skulle överväldiga verkliga antimikrobiella medel, vilket kräver ett stort antal uppföljnings endpoint cytotoxicitetsanalyser för upplösning.

Således var det av stort intresse att kunna bedöma eukaryot cellviabilitet och intracellulär tillväxt samtidigt. Noterbart är en egenskap av icke-viabla eukaryota celler förlust av cellmembranintegritet. Prober som testar permeabiliteten av cellmembranet kan därför användas för att bedöma cellviabilitet. Vi tidigare karaktäriserat förmågan hos en serie av förmodat cellmembran impermeant, fluorescerande, DNA-bindande färgämnen för att få tillgång till och ge fläckar kärn-DNA av döda celler. ⁴ Den bindande nukleärt DNA, dessa färgämnen visar en stor ökning av quantum fluorescerande utbyte resulterar i ökad signal över bakgrunds lösning fluorescens. Som sådana dessa färgämnen förutsatt en kvantitativ avläsning av eukaryot celldöd. ⁴ Särskilt fann vi att flera var giftfri sig under långvarig samtidig inkubation med J774 makrofager. När läggas under den första infektionen, de tillhandahöll en realtid, fluorescerande avläsning av eukaryot celldöd som kan mätas genom en mikro fluorimeter eller observeras mikroskopiskt.

Därför genom att kombinera användning av en bakteriell reporter och giftfri, membran ogenomtränglig, DNA-bindande färgämnen, kunde vi utveckla en enkel, icke-förstörande, realtidsanalys för att mäta både bakteriehalten och eukaryota celler cytotoxicitet samtidigt. Denna analys har gjort det möjligt för oss att screena i 384-brunnar format ~ 10000 kända bioaktiva substanser inklusive ~ 250 antimikrobiella och> 240.000 små molekyler med funktionellt karaktäriserad aktivitet för förmågan att hämma intracellulär tillväxtLegionella pneumophila, medan på samma gång generera eukaryota cell cytotoxicitet data för varje förening. ⁶ Vår analys av kända antimikrobiella medel mot intracellulär tillväxt av Legionella var den mest omfattande undersökning av denna typ hittills. ⁶

Baserat på effektiviteten i vår analysformat, vi senare undersökte också de potentiellt synergistiska effekterna av kända antimikrobiella medel när de används i kombination. En av de vanligaste synergitester, den så kallade checkerboard-analysen, är standardmässigt utförs genom att bedöma kombinatoriska effekter av två-faldiga seriespädningar av två eller flera antimikrobiella medel. ¹⁰ I dessa analyser är synergi definieras av observationen av större effekt när två eller flera antimikrobiella medel används tillsammans än summan av effekterna av varje tillämpas separat. Notera hittills bara fokuserat och selektiv samverkan test utfördes mot intracellulära Legionella pneumophila </em> på grund av den stora insats som krävs i traditionella endpoint analyser multiplicerat med kombi permutationer krävs.

För att underlätta samverkan testning, gjorde vi användning av vår realtids intracellulär tillväxt / eukaryot cytotoxicitetsanalys i kombination med automatiserad digital dispenseringsteknik ^6. Denna automatisering möjligt för oss att dispensera seriespädningar av föreningar lösta i DMSO eller vattenlösning ensamma eller i kombination i 384-brunnsformat. ¹¹ Vidare medgivit en sådan robust flytande teknik hantering oss att enkelt utföra högre upplösning, kvadratroten av två-(snarare än den vanliga, lägre upplösning, en fördubbling) utspädnings kombinationer för att uppnå högre nivåer av specificitet i vår tvådimensionella, schack synergi analys. Resolutionen var särskilt värdefullt att ta itu med problem i samverkan fältet om reproducerbarhet när tvåfaldig spädningsserie ^12. Slutligen vår analys var kvantitativt och även finsöre mätt graderingar av inhibition. Som ett resultat, analysen fångade helheten av inhiberande informationen, som kan uttryckas i isokontur isobolograms där isocontours ansluta kombinatoriska koncentrationer med liknande nivåer av tillväxthämning. ⁶ Denna plottning strategi tillät visualisering av kombi dos-responskurvor. För att illustrera vår metodik, beskriver vi våra protokoll för att utföra dessa analyser och visar representativa resultat.

Protocol

1. Real Time Intracellulär tillväxt och eukaryot cell cytotoxicitet Förbereder värdceller (J774A.1 Cells) Kultur J774A.1 Mus musculus makrofagliknande celler i suspension i RPMI 1640 med 9% järn-kompletterat kalvserum. Inledningsvis passage i vävnadsodlingskolvar. Efter det att cellerna har blivit sammanflytande i en 75 cm 2 vävnadsodlingskolv på 15 ml medium, uppdelad genom skrapning och utspädning till 65 ml med samma typ av medium, varav 15 ml återförs till vävnadso…

Representative Results

Mikroplattan intracellulära tillväxtanalys Figur 1 visar i diagramanalyssteg. De automatiserade stegen som visas kan utföras manuellt. Dock är genomströmningen underlättas avsevärt med hjälp av system vätskehantering. Figur 2 visar representativa resultat från en 384-brunnars mikroplatta, dual-avläsning i realtid intracel…

Discussion

Vi beskriver realtids analyser för samtidig detektion av intracellulära bakterietillväxt och värdcell cytotoxicitet. Det finns flera viktiga steg i protokollet. Först för robust analysprestanda, måste det finnas tillräckligt spektral separation mellan bakterie- och cytotoxicitet avläsning. En sådan separation är inneboende för kombinationer av luciferas Operon reportrar och fluorescerande DNA-bindande färgämnen. Baserat på vår erfarenhet (Tabell 1-3, Figur 2), användnin…

Materials

J774A.1 cells	American Type Culture Collection	TIB-67	Host cell
ACES	Sigma-Aldrich	A9758	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered	Becton-Dickinson/Difco	210929	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt	Sigma-Aldrich	K2000	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P5280	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic	Thermo Fisher Scientific	P288-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C-7755	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate	Sigma-Aldrich	F5879	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated	Thermo Fisher Scientific	SP236-500	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water	N/A	N/A	For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade)	Sigma-Aldrich	T1895	For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation	Corning via Thermo Fisher Scientific	10-040-CV	For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red	Corning via Thermo Fisher Scientific	17-105-CV	For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade)	HyClone via Thermo Fisher Scientific	SH30034.02	For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum	Gemini Bioproducts	100-510	For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO	Thermo Fisher Scientific	S7020	For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water	Biotium	41003	For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.
Cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific	13-255-26	For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker	BellCo Glass	7744-01010	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-04	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml)	BellCo Glass	7744-16250	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-2038-07	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml)	BellCo Glass	7744-16100	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml)	ChemGlass Life Sciences	CLS-1490-038	For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	5840300	For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold	Thermo Fisher Scientific	24072670	Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture	Corning	3570	For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin	Sigma-Aldrich	PHR1088	Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark)	Sigma-Aldrich	S-4521	Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor	Thermo Fisher Scientific	Finnpipette	For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot	Epson/ICCB-L	(Custom equipment)	For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	D300	For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system	Hewlett-Packard via Tecan	T8+	For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader	Perkin-Elmer	(Contact manufacturer)	For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera	Nikon	Ti	For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C	For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6	Adobe		Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10	Wolfam		For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.