대뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 기능의 평가
Summary
내피 세포의 미토콘드리아는 혈액 – 뇌 장벽 무결성을 유지하는 것이 중요하다. 우리는 대뇌 혈관 내피 세포에 생체 에너지 기능을 측정 할 수있는 프로토콜을 소개합니다.
Abstract
혈액 – 뇌 장벽 (BBB)의 무결성 뇌 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 뇌 혈관 내피 (CVE) BBB 셀을 구성하는 세포 형 중 하나이며; 이들 세포는 최적의 미토콘드리아 기능을 필요로하는 매우 높은 에너지 수요를 갖는다. 질병 또는 부상의 경우, 이들 세포에서의 미토콘드리아 기능 질환 또는 BBB의 개방의 결과로, 변경 될 수있다. 이 논문에서는 전체 그대로 세포 및 bioanalyzer CVE를 사용하여 세포에서 미토콘드리아의 기능을 측정하는 방법을 소개한다. 미토 응력 분석은 물리적으로나 화학적으로 교란 된 셀 도전, 및 생체 에너지 함수를 계산하는데 사용된다. 또한이 방법은 미토콘드리아 기능에 직접적인 영향을 미칠 새로운 치료제를 스크리닝하는 유용한 방법을 제공합니다. 우리는 미토콘드리아 파라 다양한 계산을 허용 산소 소비 속도를 산출하기 위해 필요한 셀 밀도를 최적화 한ATP 생산, 최대 호흡, 및 예비 용량을 포함 미터. 또한 마이크로 RNA 미르-34A의 도입 미토콘드리아 활성의 현저한 감소 및 검출 리드 것을 입증함으로써 분석의 감도를 나타낸다. 이 논문에 도시 된 데이터가 bEnd.3 세포주에 대해 최적화되지만, 또한 상기 전임상 및 임상 모델에서 유용성을 시사 CVE 차 전지용 프로토콜을 최적화했다.
Introduction
널리 대뇌 혈관 내피 (CVE) 세포에 의해 형성되는 혈액 – 뇌 장벽 (BBB)이 혈관 생물학 중요 매우 독특하고 고유 한 기능을 가지고 있음을 인식하고 있습니다. 이러한 내피 세포는 화학 에너지 원으로서 아데노신 트리 포스페이트의 셀룰러 공급 (ATP)의 대부분을 생성하는 미토콘드리아를 사용한다. CVE 전지용 ATP를 제공 할뿐만 아니라 미토콘드리아 1-4 시그널링 셀룰러로서 혈관 내피 세포의 다양한 세포 과정 아폽토시스 5 및 세포주기의 조절 및 세포 성장 6. CVE 세포에서 미토콘드리아 생체 에너지 함수의 조절 이상을 조절 손상된 혈관 내피 세포의 활동을 선도, 미토콘드리아 생물에 영향을 미칠 및 뇌 혈관 질환과 신경 퇴행성 질환, 예를 들어, 뇌졸중 7,8 및 알츠하이머 병 (AD) 9 악화시킬 수 있습니다. 우리는 CVE 세포에 모욕이 lipopolysac에 노출된다는 것을 증명하고있다charide은 (LPS)는 CVE 세포에서 미토콘드리아의 기능을 손상과 뇌졸중 7 성과 악화. 급 히드로퀴논 (TBHQ)는 CVE 셀 (10)의 산화 적 인산화를 방해하여 뇌졸중 사망률을 증가시킨다. 따라서, CVE 세포뿐만 아니라 조종사 중추 신경계에 대한 메커니즘 관련 연구 시리즈 (CNS) 질환의 생체 에너지 함수의 정량적 모델뿐만 아니라, 혈관 생물학에서 미토콘드리아의 기능을 표적 치료제의 약물 검사에서 돌파구를 제공합니다.
격리 미토콘드리아는 생체 에너지 함수를 측정하는 데 사용되어왔다. 우리 7 등 (11)는 세포 외 플럭스 bioanalyzer를 사용하여 그대로 CVE 세포에서 세포 생물 에너지 학의 평가를보고했다. 분석기는 내인성 세포의 생체 에너지 평가의 이점을 제공한다. 민감한 일관된 분석은 CVE 세포의 미토콘드리아 대사를 측정함으로써 생체 에너지 STI 손상을 평가할 수있다muli는 CVE 세포에서 미토콘드리아의 기능에 영향을 미치는 미토콘드리아 신호 전달 경로의 메커니즘 및 화면 약물이나 치료를 조사합니다. 이 프로토콜에서, 로테 논 및 antimycin의 A. oligomycin, 카르 보닐 시아 나이드 -4- (트리 플루오 로메 톡시) 페닐 (FCCP) 산소 소모 속도 (OCR)는 네 개의 미토콘드리아 장애 물질의 사용을 조합하여 약리 프로파일 링 방법을 사용하여 bioanalyzer 의해 기록 우리는 세부 사항 하나의 분석에서, 측정 및 기초 미토콘드리아 호흡, ATP 생산, 양성자 누출, 최대 호흡, 및 예비 호흡기 용량을 포함 CVE 세포에서 미토콘드리아 기능 매개 변수의 계산이 가능하게 최적화 된 접근 방식을.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 뇌 혈관 내피 세포의 생체 에너지 표현형의 평가 방법을 나타낸다. 이는 내피 세포의 미토콘드리아 평가 기본적인 역할 분석, 그리고 CVE 세포에서 미토콘드리아 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수있는 자극의 기작을 조사하기위한 실험에 적합하다. 또한 BBB 단절 – 관련 질병에 대한 잠재적 치료제를 시험하기위한 방법을 제공한다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
외 플럭스 bioanalyzers 실시간 OCR을 측정 할 수있다. 이 분석에서, 상기 적절한 셀 밀도를 식별하는 것은 중요하다. 세포 밀도는 웰 당 8 × 103 세포를 밑도는 경우, 기저 OCR은 (도 2 및도 3)를 분석하기에 너무 낮다; 세포 밀도는 웰 당 32 × 103 세포를 초과하면, 세포 또는 oligomycin FCCP의 자원 처리에 응답하지 않는다국세청 (그림 2와 그림 3). 우리의 실험 모델에서이 세포주에 대한 최적의 세포 밀도는 7 트리트먼트 10, 14를 자극에 복제 결과와 감도를 보여줍니다 아니라, 당 16 × 10 3 세포이다. 24 웰 bioanalyzer가 사용되는 경우, 세포 밀도는 새로운 적정 분석을 위해 요구 될 것이다.
된 CVE 다른 내피 세포 또는 조직 유형 15,16 미토콘드리아에 비해 많은 양이 그것이 큰 에너지 생산 및 생체 에너지 대사를 측정하기위한보다 적은 세포의 필요성을 시사 설명한다. 우리는 주와 같은 뇌 내피 세포의 여러 종류를 테스트하고 쥐의 뇌 혈관 내피 세포 (7) 불후 인간의 뇌 혈관 내피 세포 (게시되지 않은 데이터) 불후있다. 160 pmol의 / 분 -이 셀 (40) 내에 수용 OCR (기저 호흡 OCR 도달하는 유사한 세포 밀도를 필요96 웰 플레이트 및 50-24 웰 플레이트, 400 pmol의 / 분)에 생체 에너지 분석을 수행 하였다. Kaczara 외. 높은 세포 밀도 (17)를 사용하여 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVEC)에서 생체 에너지 대사를 측정보고 하였다.
우리 그룹은 다른 조직이나 장기에서 혈관 세포를 평가하지 않았다. 이론적 bioanalyzer 잠재적 셀 타입에 이용 될 수 있지만, 세포 밀도, 세포 배양 배지와 배양 조건 (일부 특정 세포가 잘 성장할 플레이트 코팅 필요할 수 있음)에 대한 분석을 최적화 할 필요. 이 실험은 OCR 속도가 허용 가능한 범위 내에 있도록 완료되도록 요구된다. 다른 기관으로부터 내피 세포의 OCR 셀 밀도가 증가 된 CVE 뇌에서보다 낮은 경우 OCR 허용 범위 내에서 얻을 수 있습니다. 세포가 에너지를 그들의 주요 소스로 산화 적 인산화를 사용하지 않는 경우 또는의 bioanalyzer는 OPTIMA되지 않을 것리터 분석.
bioanalyzer는 시약이 적용되는 순서에 기초하여, 전자 전달계의 순차적 중단을 허용한다. 먼저 oligomycin 미토콘드리아는 단지 V (ATP 합성 효소)를 억제하는인가된다. 둘째, FCCP, 전자 uncoupler는 양성자 구배의 파괴에 이르게하는인가된다. 마지막으로, 미토콘드리아 단지 I 및 III을 억제 로테 antimycin 및 A는, 각각 전자 흐름 총 억제 리드에 적용된다. 약물 노출 순서는 약물 특정 전자 전달계 반응을 차단하기 때문에 필수적이며, 순차 변화는 미토콘드리아의 기능을 반영하기 위해 측정 될 수있다.
수정 및 문제 해결
CVE 세포에서 미토콘드리아 자극에 반응을 평가하기 위해, 세포가 세포 배양 플레이트의 바닥에 부착 된 후 자극 (막대 표시 셀에인가되는 것을 권장도 1에 도시; 보통) 적어도 6 시간이 걸립니다. 치료법으로 복제 결과를 얻기 위해서는, 일치 셀 밀도를 유지하는 것이 매우 중요하다. 전처리는 세포 파종하기 전에 설계하는 경우, 각각의 전처리를위한 세포 밀도는주의 깊게 파종의 죽은 세포를 제외하고 측정해야한다. 형질는 실험 디자인에 포함되는 경우, 제조자의 형질 감염 프로토콜을 참조. 도 4에 제시된 데이터에서 보여 미르-34A 미르-34A의 과발현과 대사 기능의 변화를 평가하기 위해 항생 물질이없는 세포 배양 배지 및 미토 스트레스 테스트를 필요로 리포 펙 타민 형질 전환 키트를 사용하여 CVE 세포로 형질 감염시켰다 . 이전 13 공표 플라스미드의 용량은 또한 최적화 될 수있다. 프로토콜에 따라 제조 될 수있는 또 다른 변화는 시약의 농도를 변경한다. oligomycin, FCCP 및 / 또는 로테 및 Antimycin (A)의 적정 곡선 일 수 공단테드.
높은 처리량에 사용이 분석은 다양한 약물의 분석을하는 경우뿐만 아니라, 그 세포 생존하고 이전의 공보에서 설명되었다 7,13 세포 증식을 측정하는 병렬 분석을 포함하도록 제안한다. 문자 인식 값은 크게 세포 수 (도 2 및 3)의 영향 및 세포 증식 및 생존 분석은 데이터의 정규화에 도움된다. 그러나 이러한 분석의 완료는 각 기관의 재량이다.
기술의 한계
이 프로토콜의 주요 한계는 우리가 단지 연구에서 시험 관내 세포 배양 모델을 사용한다는 것이다. 현재, 내피 세포의 미토콘드리아 기능을 처리 할 수 사용 가능한 생체 모델이나 동물 모델이 없습니다. 새로운 모델은 생체 내에서 생체 에너지 함수의 평가를 위해 개발 될 것으로 예상되며 <em> 생체 미래 연구한다.
또 다른 제한은 생물 에너지 학 조치 다음 장벽 평가의 확장입니다. 첫째, 생체 에너지 측정 종료 후, 세포 생존율은 전자 전달계의 완전한 붕괴 다음 감소되기 때문 실험을 수행 할 수 없다; 둘째, 특정 세포 배양 접시와 삽입은 생물 에너지 학 값을 감지해야하며 장벽 평가를위한 삽입에 적합하지 않습니다. 따라서, 생물 에너지 학 분석 한 후 완료 할 수있는 많은 기능 분석이되지 않습니다. 그러나, 특별한 장치가 생체 에너지 세이 이전 기능 분석을 수행하도록 개발 될 수있을 것으로 기대된다.
기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성
미토콘드리아의 기능을 평가하기 위해 이전 기술은 셀 (18)로부터 미토콘드리아의 분리를 필요로. 이 북동bioanalyzer를 사용하여 w 기술은 고립 된 미토콘드리아를 평가보다 세포 환경을 더 많이 보존 손상 세포에서 미토콘드리아 활동의 측정을 할 수 있습니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향
이 프로토콜 설계 및 bEnd.3 세포주 개발뿐만 아니라 일차 대뇌 혈관 내피 (pCVE) 셀 (7) 또는 다른 내피과 호환 가능하며, 우리는 pCVE 전지 7을 이용하여 이전 출판물이 입증된다. 내피 세포의 다른 유형을 사용할 경우, 배양 판의 코팅 및 성장 인자의 사용이 요구 될 수있다. 그러나, 적정 분석은 다른 세포 유형을 권장합니다. 이 프로토콜은 CVE 세포의 생체 에너지의 평가에 채택 될 수있는 일반적인 방법을 제공하고, 더 나아가 장치의 연구 또는 이러한 방식으로 치료 학적 반응에 적용될 수있다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: AHA 16SDG31170008 to X.R. and NIH P20 GM109098, P01 AG027956, and U54 GM104942 to J.W.S.
Materials
| bEnd.3 cell line | ATCC | CRL-2299 | 25-30 passages |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ATCC | 30-2002 | |
| Fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S12450 | 10% in final |
| Penicillin/Steptomycin | Hyclone | SV30010 | 1×100 stocking |
| 0.25% trypsin 0.03% EDTA solution | Corning | 25-053-CI | |
| Sodium pyruvate | Corning | 25-000-CI | 1.0 µM in final |
| Glucose | Sigma | CAS 50-99-7 | 25 mM in final |
| Oligomycin | Sigma | O4876 | 1.0 µM in final |
| Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | 0.5 µM in final |
| Rotenone | Sigma | R8875 | 1.0 µM in final |
| Antimycin A | Sigma | CAS 1397-94-0 | 1.0 µM in final |
| Plate wash station | Seahorse Bioscience | ||
| Extracellular flux bioanayzer | Seahorse Bioscience | XFe96 | |
| Extracellular flux cell culture plate | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux sensor cartridge | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
| Extracellular flux calibrant solution | Seahorse Bioscience | 100840-000 | |
| Extracellular flux assay medium | Seahorse Bioscience | 102365-100 | PH buffered prior to assay |
Referências
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