Utvikling av en hepatitt B virus Reporter system for å overvåke tidlige stadier av Replication Cycle

Summary

Her beskriver vi en nyutviklet hepatitt B-virus (HBV) reporter system for å overvåke de tidlige stadier av HBV-livssyklusen. Denne forenklede in vitro-system skal hjelpe til screening av anti-HBV-midler ved hjelp av en high-throughput-strategi.

Abstract

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Introduction

Kronisk infeksjon med hepatitt B-virus (HBV) er en viktig risikofaktor for kroniske leversykdommer ^1. Selv om dagens terapeutiske strategier er basert på nukleotid-analoger som hemmer HBV pol funksjon og / eller administrering av type I interferon som aktiverer immunresponser hos infiserte individer, så vel som indirekte å undertrykke HBV spredning gjennom interferon-stimulerte genfunksjoner ^2, kan disse behandlingene ikke eliminere HBV DNA helt ^tre. Videre fremveksten av HBVs som er resistente mot anti-pol midler er av interesse ^4. Administrasjonen av kombinerte antivirale midler direkte rettet mot de ulike trinnene i humant immunsviktvirus (HIV) eller hepatitt C virus (HCV) livssyklus ble vist å kunne undertrykke eller utrydde viruset (es). I likhet med denne ideen, utvikling av anti-HBV middel (e) som virker direkte på de ulike stadier av HBV livssyklus er viktig for å etablere fremtidige HBV-terapier.

Generelt, etablering av en enkel in vitro kultursystem av målet viruset forenkler utviklingen av antivirusmidler. Det er imidlertid minst to barrierer for utvikling av in vitro kultursystemer for å screene anti-HBV-midler. Den første er mangelen på en enkel in vitro-cellekultursystem for HBV-infeksjon / proliferasjon. I motsetning til andre virus, slik som HIV og HCV, som forplanter seg i etablerte cellelinjer, er det vanskelig å dyrke HBV in vitro på grunn av eksperimentelle begrensninger, inkludert et snevert vertsområde. Bruken av spesifikke cellekultursystemer som for eksempel den humane hepatom-cellelinje HepaRG, som er utsatt for HBV-infeksjon, ^{5, 6, 7} er blitt utviklet for å overvinne disse problemene. Videre PXB celler, isolert fra urokinase-type plasminogen aktivator transgene / SCID mus inokulert med primære humane hepatocytter (PHH), viste seg å være utsatt for HBV-infeksjon og replikasjon ^8. Men HBV replikasjonsnivået i HepaRG er avhengig av cellulær differensiering tilstand etter kultur, noe som kan føre til inkonsistente og uforklarlige resultatene av HBV infeksjon / replikering nivåer. PXB er ofte brukt for HBV smitteforsøk, men er begrenset av sin tilgjengelighet. En tetracyklin-induserbar ekspresjon av HBV-cellelinje, HepAD38, har også blitt mye brukt til å studere HBV replikasjon, men dette systemet tillater bare evaluering etter transkripsjon, og ikke på inngangstrinnet av HBV-infeksjon ^9. Nylig har identifikasjon av natriumtaurocholat cotransporting polypeptid (NTCP) som en funksjonell reseptor for HBV er tillatt utviklingen av en variabel HBV kultursystem ^10. Faktisk NTCP uttrykk i ikke-følsomme hepatokarsinom celler som Huh7 ogHepG2 gjør det mulig for HBV-infeksjon ¹⁰ og dermed har valget av HBV mottagelig cellelinjer blitt utvidet, løse mange av de eksperimentelle begrensninger. Det andre problem er mangelen på en enkel bestemmelsessystem for å evaluere HBV-infeksjon og replikasjon. Evaluering av HBV-infeksjon blir vanligvis utført ved å analysere HBV DNA, RNA og proteiner. Imidlertid kvantifisering av disse virus markørene er tidkrevende, kostbart og ofte ikke alltid er enkelt. Derfor er utviklingen av et enkelt assay-system, for eksempel ved hjelp av et reporter-gen, kan overvinne problemene forbundet med HBV analysesystemer.

Imidlertid, fordi den genomstørrelse som kan pakkes inn i en HBV kapsid er begrenset – mindre enn 3,7 kb ¹¹ – størrelsen på et reportergen bør være så kort som mulig. Videre, tilstedeværelsen av flere cis-elementer er spredt over hele genomet, som er essensielle for virusreplikasjon, begrenser de stillinger som er tilgjengelige for i sertion av reportergenet i genomet. Flere rapporter har forsøkt å sette inn fremmede gener, inkludert HIV-1 Tat, grønt fluorescerende protein, og DsRed, inn i HBV-genomet ^{11, 12, 13.} Men disse rekombinante HBVs ikke er nyttige for screening av HBV-infeksjon / replikasjon, eller for high-throughput screening av faktorer som påvirker HBV-infeksjon / replikasjon. Dette er hovedsakelig på grunn av den lave produktivitet av rekombinante virus og den reduserte intensitet av reportergenekspresjon skyldes ineffektiv virusproduksjon.

For å overvinne disse problemene, konstruerte vi et reporter HBV med et høyt utbytte av virusproduksjon. Dette viruset er svært følsom for overvåking av de tidlige stadiene av den HBV-replikasjonssyklus, fra inngang til transkripsjon. For å oppnå dette, ble NanoLuc (NL) valgt som et markør-gen, fordi det er en liten (171 aminosyrer) konstruert luminescerende reporterclass = "xref"> 14. Videre er NL ca 150 ganger lysere enn ildflue eller Renilla luciferase, og den selvlysende reaksjonen er ATP-uavhengig, noe som tyder på at den falske hit rate vil være lav for høy gjennomstrømming screening. Den produksjonseffektivitet av det rekombinante HBV er omtrent 1/5 av den overordnede HBV, og tilsvarende nivå som er rapportert for tidligere HBV rekombinante virus; imidlertid, vil lysstyrken NL overvinner virus produktivitets problemer slik at den kan brukes for masse screening av anti-HBV-midler.

Screening av anti-HBV-midler ved hjelp av primære hepatocytter kan HepaRG, HepAD38 og NTCP-transduserte hepatocytter være nyttige for screening av anti-HBV-midler ved konvensjonell metode (r). Imidlertid er systemet som er beskrevet her har en rekke fordeler som enkel håndtering, høy følsomhet og lav kostnad for screening. Disse fordelene er egnet for høy gjennomstrømning analyser for å utvikle og identifisere nye HBV midler til terapeutiske formål.

Protocol

1. Produksjon av rekombinant HBV Koding Reporter Protein Utarbeidelse av HepG2 celler Fremstille cellekulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 100 U / ml ikke-essensielle aminosyrer). Plate 4 x 10 6 HepG2-celler i en 10-cm kollagen-belagte fatet i 10 ml kulturmedium dagen før transfeksjon. Inkuber HepG2 celler ved 37 ° C i en fuktig 5%</sub…

Representative Results

Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av HBV-genomet, transkriberte RNA, virusproteiner og deres kodende område i genomet. Reporteren genet og dens plassering i genomet er også indikert. Figur 2 viser HBV reporter plasmid og hjelper-plasmid som inneholder reportergenet. Den pUC1.2HBV / NL reporter ble konstruert ved å slette nukleotidposisjoner 223-811 fra transkripsjons-initierings-setet av den Precore mRNA av pUC1.2HBV 16 …

Discussion

HBV-genomet har fire primære åpne leserammer (ORF) inkludert i kjernen, polymerase, overflate og X-ORF (figur 1). Transkripsjon av disse fire HBV ORF er strengt regulert av fire arrangører: den Precore / core promoter inneholder Enhancer II, S1 promoter, S2 promoter og X promoter inneholder enhancer jeg ^18. 3,5 kb og 3,4 kb mRNA er oversatt til Precore og Core proteiner, henholdsvis. Den store innhylle protein (L) er produsert fra den største subgenomt mRNA (2,5 kb), og den m…

Materials

Nano-Glo Luciferase Assay Regent	Promega	N1110
Penicillin-Streptomycin Mixed Solution	Nacalai tesque	09367-34
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Thermo Fisher Scientific	11140050
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
100 mm/collagen-coated dish	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	L3000001
Polyethylene glycol (PEG) 6000	Sigma-Aldrich	81255
Polyethylene glycol (PEG) 8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/l-EDTA Solution	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter	Merck Millipore	SLHP033RS
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Collagen coated 96-well plate	Corning	NO3585
Passive Lysis 5xBuffer	Promega	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	Promega	E6501
Sucrose	Nacalai tesque	30403-55
Luminometer plate	Greiner bio-one	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	–	–	Reference 15
pUC1.2HBV delta epsilon	–	–	Reference 15
pUC1.2HBV/NL	–	–	Reference 15
50 ml tube	Violamo	1-3500-02
Anti-Myc antibody	Sigma-Aldrich	C3956
HBIG	Japan Blood Products Organization	–
IFN-β	Mochida Pharmaceutical	14987224005413
Heparin	Sigma-Aldrich	H3393