Utveckling av en hepatit B-virus Reporter system för att övervaka de tidiga stadierna av replikationscykeln
Summary
Här beskriver vi en nyutvecklad hepatit B-virus (HBV) reportersystem för att övervaka de tidiga stadierna av HBV-livscykeln. Denna förenklade in vitro-system kommer att hjälpa till vid screening av anti-HBV-medel med användning av en hög genomströmning strategin.
Abstract
Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.
Introduction
Kronisk infektion med hepatit B-virus (HBV) är en stor riskfaktor för kroniska leversjukdomar 1. Även om nuvarande terapeutiska strategier är baserade på nukleotidanaloger som hämmar HBV pol funktion och / eller administrering av typ I interferon som aktiverar immunsvar i infekterade individer samt indirekt undertrycka HBV spridning genom interferon-stimulerade genfunktioner 2, kan dessa behandlingar inte eliminera HBV DNA helt 3. Dessutom är uppkomsten av HBVs som är resistenta mot anti-pol medel till oro 4. Administrationen av kombinerade antivirala medel direkt inriktade på olika stegen i humant immunbristvirus (HIV) eller hepatit C-virus (HCV) livscykel visades framgångsrikt undertrycka eller utrota viruset (er). Liknar denna idé, utveckling av anti-HBV-agens (er) som verkar direkt på de olika stegen i HBV livscykel är viktigt för att etablera framtida HBV terapier.
I allmänhet, inrättandet av en enkel in vitro-kultursystem av målet viruset underlättar utvecklingen av antivirusmedel. Men det finns åtminstone två hinder för utvecklingen av kultur in vitro-system för att screena anti-HBV-medel. Den första är bristen på en praktisk in vitro cellkultursystem för HBV-infektion / proliferation. Till skillnad från andra virus, såsom HIV och HCV, som fortplantas i etablerade cellinjer, är det svårt att odla HBV in vitro på grund av experimentella begränsningar inklusive ett smalt värdområde. Användning av specifika cellkultursystem, såsom den humana hepatomcellinjen HepaRG, som är känslig för HBV-infektion, 5, 6, har 7 utvecklats för att övervinna dessa problem. Dessutom PxB celler, isolerade från urokinas-type plasminogenaktivator transgena / SCID-möss ympade med primär human hepatocyte (PHH), visade sig vara mottagliga för HBV-infektion och replikering 8. Men HBV-replikation nivåer i HepaRG är beroende av celldifferentiering tillståndet efter kultur, vilket kan orsaka inkonsekventa och reproducerbara resultat av HBV-infektion / replikering nivåer. PxB används vanligen för HBV-infektion experiment, men begränsas av dess tillgänglighet. En tetracyklin inducerbar HBV uttryck cellinje HepAD38 har också använts i stor utsträckning för att studera HBV-replikation, men detta system endast tillåter utvärdering efter transkription och inte på ingångssteget av HBV-infektion 9. Nyligen har identifieringen av natriumtaurokolat cotransporting polypeptid (NTCP) som en funktionell receptor för HBV möjliggjort utvecklingen av en variabel HBV kultursystem 10. I själva verket NTCP uttryck i icke-mottagliga hepatokarcinom celler såsom Huh7 ochHepG2 möjliggör HBV-infektion 10 och därmed har valet av HBV mottagliga cellinjer utökats, lösa många av de experimentella begränsningar. Det andra problemet är bristen på ett enkelt testsystem för att utvärdera HBV-infektion och replikation. Utvärdering av HBV-infektion utförs vanligen genom att analysera HBV-DNA, RNA och proteiner. Men är kvantifiering av dessa virusmarkörer tidskrävande, ofta kostsamma och inte alltid enkelt. Därför är utvecklingen av ett enkelt analyssystem, såsom användning av en reportergen, kan övervinna problem som är associerade med HBV analyssystem.
Emellertid, därför att genomstorleken som kan förpackas i en HBV-kapsid är begränsad – mindre än 3,7 kb 11 – storleken av en reportergen bör vara så kort som möjligt. Vidare, närvaron av multipla cis-element utspridda i genomet, som är väsentliga för viral replikation, begränsas de lediga tjänster för i sertion av reportergenen i genomet. Flera rapporter har försökt att sätta in främmande gener, inklusive HIV-1 Tat, grönt fluorescerande protein, och DsRed, in i HBV-genomet 11, 12, 13. Emellertid är dessa rekombinanta HBVs är inte användbara för screening av HBV-infektion / replikation, eller för high-throughput screening av faktorer som påverkar HBV-infektion / replikation. Detta är främst på grund av den låga produktiviteten av rekombinanta virus och minskad intensitet av reporter genuttryck orsakas av ineffektiv virusproduktionen.
För att övervinna dessa problem, konstruerade vi en reporter HBV med ett högt utbyte av virusproduktion. Detta virus är mycket känslig för att övervaka de tidiga stadierna av HBV-replikationscykeln, från inträde till transkription. För att uppnå detta, var NanoLuc (NL) valdes som en markörgen för att det är en liten (171 aminosyror) engineered luminescent reporterclass = "xref"> 14. Dessutom är NL cirka 150 gånger starkare än eldfluga eller Renilla luciferas, och ljusreaktionen är ATP-oberoende, vilket tyder på att den falska träffsäkerhet kommer att vara låg för high-throughput screening. Produktionseffektiviteten av den rekombinanta HBV är ungefär 1/5 av moder HBV, och liknande till nivåer som rapporterats för tidigare HBV rekombinanta virus; emellertid ljusstyrkan i NL övervinner virusproduktivitetsfrågor så att den kan användas för mass screening av anti-HBV-medel.
Screening av anti-HBV-medel med användning av primära hepatocyter, kanske HepaRG, HepAD38 och NTCP-omvandlade leverceller vara användbara för screening av anti-HBV-medel genom konventionell metod (er). Det system som beskrivs här har olika fördelar, såsom enkel hantering, hög känslighet, och låg kostnad för screening. Dessa fördelar är lämpliga för hög genomströmning analyser för att utveckla och identifiera nya HBV-medel för terapeutiska ändamål.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBV-genomet har fyra primära öppna läsramar (ORF) inklusive kärnan, polymeras, yta och X ORF (Figur 1). Transkription av dessa fyra HBV ORF är hårt reglerad av fyra promotorer: den förkärna / core promotor som innehåller förstärkare II, S1-promotor, S2 promotorn och X-promotorn innehåller förstärkare I 18. De 3,5 kb och 3,4 kb mRNA översätts till förkärna och kärnproteiner, respektive. Den stora kuvert protein (L) framställs av den största subgenomiska mRNA (…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported in part by the Research Program on Hepatitis from Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) and by Grants-in-Aids for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT) of Japan.
Materials
| Nano-Glo Luciferase Assay Regent | Promega | N1110 | |
| Penicillin-Streptomycin Mixed Solution | Nacalai tesque | 09367-34 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995065 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| 100 mm/collagen-coated dish | Iwaki | 4020-010 | |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 6000 | Sigma-Aldrich | 81255 | |
| Polyethylene glycol (PEG) 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| NaCl | Nacalai tesque | 31319-45 | |
| 0.5 mol/l-EDTA Solution | Nacalai tesque | 06894-14 | |
| Tris-HCl | Nacalai tesque | 35434-21 | |
| Millex-HP, 0.45 μm, polyethethersulfone, filter | Merck Millipore | SLHP033RS | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Collagen coated 96-well plate | Corning | NO3585 | |
| Passive Lysis 5xBuffer | Promega | E1941 | |
| GloMax 96 Microplate Luminometer | Promega | E6501 | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30403-55 | |
| Luminometer plate | Greiner bio-one | 655075 | |
| HepG2-NTCP1-myc-clone22 | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV delta epsilon | – | – | Reference 15 |
| pUC1.2HBV/NL | – | – | Reference 15 |
| 50 ml tube | Violamo | 1-3500-02 | |
| Anti-Myc antibody | Sigma-Aldrich | C3956 | |
| HBIG | Japan Blood Products Organization | – | |
| IFN-β | Mochida Pharmaceutical | 14987224005413 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 |
Referências
- Fattovich, G., Stroffolini, T., Zagni, I., Donato, F. Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors. Gastroenterology. 127 (5), 35-50 (2004).
- Revill, P., Testoni, B., Locarnini, S., Zoulim, F. Global strategies are required to cure and eliminate HBV infection. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 13 (4), 239-248 (2016).
- Wursthorn, K., et al. Peginterferon alpha-2b plus adefovir induce strong cccDNA decline and HBsAg reduction in patients with chronic hepatitis B. Hepatology. 44 (3), 675-684 (2006).
- Stuyver, L. J., et al. Nomenclature for antiviral-resistant human hepatitis B virus mutations in the polymerase region. Hepatology. 33 (3), 751-757 (2001).
- Ochiya, T., Tsurimoto, T., Ueda, K., Okubo, K., Shiozawa, M., Matsubara, K. An in vitro system for infection with hepatitis B virus that uses primary human fetal hepatocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86 (6), 1875-1879 (1989).
- Galle, P. R., Hagelstein, J., Kommerell, B., Volkmann, M., Schranz, P., Zentgraf, H. In vitro experimental infection of primary human hepatocytes with hepatitis B virus. Gastroenterology. 106 (3), 664-673 (1994).
- Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99 (24), 15655-15660 (2002).
- Murakami, Y., et al. Discovering novel direct acting antiviral agents for HBV using in silico screening. Biochem. Biophys. Res. Commun. 456 (1), 20-28 (2015).
- Ladner, S. K., et al. Inducible expression of human hepatitis B virus (HBV) in stably transfected hepatoblastoma cells: a novel system for screening potential inhibitors of HBV replication. Antimicrob. Agents. Chemother. 41 (8), 1715-1720 (1997).
- Yan, H., et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide is a functional receptor for human hepatitis B and D virus. Elife. 3, (2012).
- Wang, Z., et al. Replication-competent infectious hepatitis B virus vectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viral polymerase translation. PLoS. One. 8, 60306 (2013).
- Chaisomchit, S., Tyrrell, D. L., Chang, L. J. Development of replicative and nonreplicative hepatitis B virus vectors. Gene. Ther. 4 (12), 1330-1340 (1997).
- Hong, R., et al. Novel recombinant hepatitis B virus vectors efficiently deliver protein and RNA encoding genes into primary hepatocytes. J. Virol. 87 (12), 6615-6624 (2013).
- Hall, M. P., et al. Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. ACS. Chem. Biol. 7 (11), 1848-1857 (2012).
- Nishitsuji, H., et al. Novel reporter system to monitor early stages of the hepatitis B virus life cycle. Cancer. Sci. 106 (11), 1616-1624 (2015).
- Sugiyama, M., et al. Influence of hepatitis B virus genotypes on the intra- and extracellular expression of viral DNA and antigens. Hepatology. 44 (4), 915-924 (2006).
- Seeger, C., Zoulim, F., Mason, W., Knipe, D., Howley, P. Hepadnaviruses. Field Virology. Volume 1. , 2185-2221 (2013).
- Moolla, N., Kew, M., Arbuthnot, P. Regulatory elements of hepatitis B virus transcription. J. Viral. Hepat. 9 (5), 323-331 (2002).
- Cattaneo, R., Will, H., Schaller, H. Hepatitis B virus transcription in the infected liver. EMBO. J. 3 (9), 2191-2196 (1984).
- Enders, G. H., Ganem, D., Varmus, H. Mapping the major transcripts of ground squirrel hepatitis virus: the presumptive template for reverse transcriptase is terminally redundant. Cell. 42 (1), 297-308 (1985).
- Haines, K. M., Loeb, D. D. The sequence of the RNA primer and the DNA template influence the initiation of plus-strand DNA synthesis in hepatitis B virus. J. Mol. Biol. 370 (3), 471-480 (2007).
- Hirsch, R. C., Lavine, J. E., Chang, L. J., Varmus, H. E., Ganem, D. Polymerase gene products of hepatitis B viruses are required for genomic RNA packaging as well as for reverse transcription. Nature. 344 (6266), 552-555 (1990).
