Хирургические процедуры и методология для модели доклинической мужи<em> Де Ново</em> Метастазы рака молочной железы
Summary
Недоклинические доклинические модели, оценивающие адъювантную терапию, нацеленную на метастазы рака молочной железы. Чтобы решить эту проблему, мы разработали мышиную модель метастаза левожелудочной молочной железы аденокарциномы de novo , где терапию, вводимую в адъювантной обстановке (послеоперационная резекция первичных опухолей), можно оценить для эффективности при воздействии ранее высеваемых легочных метастазов.
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
Женщины в Северной Америке имеют ~ 12% пожизненный риск развития рака молочной железы 2; Большинство из этих людей будут иметь первичные опухоли, удаленные хирургическим путем, и в зависимости от подтипа рака, затем получат целевую, эндокринную, химио- и / или лучевую терапию в адъювантной обстановке 3 . Примеры включают, женщин с диагнозом рака гормон рецептор-положительным , получавших анти-эстроген терапии и женщин с HER2-позитивными опухолями , получающих HER2-мишенью терапии с лучевой / химиотерапии, в то время как нет целевой терапии еще не доступны для тройных негативных опухолей 3. Несмотря на успехи в радиации, химиотерапии, персонализированный и гормонов на основе методов лечения , которые дополняют хирургическую резекцию, болезнь рецидивирует в 30-70% женщин с диагнозом II стадии или III болезни 4, как терапия в значительной степени неэффективны в искоренении метастазирования в отдаленные органы, в том числе Легкие, кости, bДождь и / или печень 5 . Это особенно важно, учитывая, что, когда метастатическая болезнь возникает при отсутствии первичного роста опухоли, это означает, что рассеянные злокачественные клетки, вероятно, уже присутствовали во вторичных органах во время окончательной операции. Таким образом, срочно необходимы терапии, способные искоренить или замедлить рост метастатических опухолей.
В то время как мышиные модели de novo для канцерогенеза молочной железы были чрезвычайно информативны в выявлении механизмов, регулирующих прогрессирование новообразований 1 , существующие модели также имеют несколько ограничений. Одним из них является тот факт, что de novo трансгенные модели обычно развивают первичные опухоли в множественных молочных железах, где первичная опухолевая нагрузка ограничивает продолжительность исследований. В то время как первичный побег опухолевых клеток и метастатическое высевание, вероятно, происходят в начале неопластического прогрессирования в этих моделях, откровенное развитие метастатических опухолей происходит поздно, и в зависимости отN модель мыши и фон деформации часто являются частично проникающими 1 . Это еще больше ограничивает полезность моделей de novo для обнаружения молекул, регулирующих метастазы во вторичных органах, и для оценки доклинической эффективности терапии в условиях адъюванта.
Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали автохтонную модель метаноза рака молочной железы в легкие de novo . Родительские трансгенные самок ( т. Е. MMTV-PyMT на фоне штамма FVB / n для исследований, описанных здесь), несущие поздние стадии опухолей молочной железы de novo, составл ют до 100 дней 6 , после чего их первичные опухоли хирургически ресецируют и ферментативно диссоциируют в Одноцепочечные суспензии. Суспензии (1 × 10 6 клеток), в свою очередь, орто-оптически экспрессируются у 6-7-недельных сингенных женских мышей-реципиентов, где одиночные первичные опухоли молочной железы развиваются в течение периода от 38 до 60 дней ( <stronG class = "xfig"> Рисунок 1A). При определенном размере опухоли (от 172 до 450 мм 3 ) мышей-реципиентов анестезируют, а первичные опухоли хирургически подвергают резекции, так что восстановление опухоли на хирургическом участке минимизируется, что согласуется с хирургией у женщин ( фиг. 1 ). На фоне штамма FVB / n мыши развивают гистологически обнаруживаемые метастатические очаги в легких с 45% -ной пенетрантностью через ~ 115 дней после операции ( рис. 1B ). Благодаря этой расширенной латентности роста метастатической опухоли модель уникально позиционируется для доставки адъювантной терапии, а также для выяснения и оценки лежащей в основе биологии, влияющей на метастатическую прогрессию после хирургического удаления первичных опухолей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Модификации и устранение неполадок:
Когда тупой рассекающий опухоль удаляется от брюшной стенки, опухоль может оставаться прикрепленной к брюшной стенке. Это наблюдалось у <5% мышей, которым вводили опухоль (данные не показаны). Для мышей с опухолями, прилипши?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность Джо Хилу за помощь в гистопатологии, д-р Джон Глейстин за обучение в хирургической технике, Тесса Дибел за помощь в видеографии, все члены лабораторий Вонг и Куссенс за критическую проницательность и дискуссии и Институт рака им. OHSU для финансовой поддержки. Авторы признают поддержку от T32GM071388-10 и T32CA106195-11 до КЭГ, NCI / NIH, Программы исследований рака молочной железы Министерства обороны, Фонда Сьюзан Г. Комен, Фонда исследований рака молочной железы и Фонда «Встать в рак – Люстгартен» Рак поджелудочной железы. Сонная трансплантация. Трансформационный исследовательский грант (SU2C-AACR-DT14-14) в LMC, награду Фонда здоровья женщин за предоставление MHW и центр здоровья поджелудочной железы Брендена-Колсона для MHW и LMC.
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
Referências
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Howlader, N. N. A., Krapcho, M. . SEER Cancer Statistics Review 1975-2008. , (2011).
- National Comprehensive Cancer Network. . Breast Cancer (Version 3.2014). , (2016).
- Kataja, V., Castiglione, M., Group, E. G. W. Locally recurrent or metastatic breast cancer: ESMO clinical recommendations for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 19 Suppl 2, 11-13 (2008).
- Margolese, R. G., Hortobagyi, G. N., Buchholz, T. A., Kufe, D. W., Pollock, R. E., Weichselbaum, R. R. . Management of Metastatic Breast Cancer. Holland-Frei Cancer Medicine. , (2003).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Mol Cell Biol. 12, 954-961 (1992).
- Kouros-Mehr, H., et al. GATA-3 links tumor differentiation and dissemination in a luminal breast cancer model. Cancer Cell. 13, 141-152 (2008).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Qian, B. Z., et al. FLT1 signalling in metastasis-associated macrophages activates an inflammatory signature that promotes breast cancer metastasis. J Exp Med. 212 (9), 1433-1448 (2015).
- Verkooijen, H. M., et al. Patients’ refusal of surgery strongly impairs cancer survival. Ann Surg. 242 (2), 276-280 (2005).
- Peinado, H., et al. Pre-metastatic niches: organ-specific homes for metastasis. Nat Rev Cancer. 17 (5), 302-317 (2017).
