ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד להעריך את הביטוי של מגוון רחב של גנים ברמה המשובטת. RT-qPCR מתחיל מתא בודד מייצר תוצאות אמינות ביותר עם רגישות חזקה במשך מאות דגימות וגנים.
Abstract
ההטרוגניות התבטאות גנים היא סממן מעניין שמן הראוי לחקור באוכלוסיות הלימפה. התבטאות גנים בתאים אלה משתנה במהלך תא ההפעלה, מתח, או גירוי. ביטוי גנים זמנית מתא בודד מאפשר הערכה סימולטני של עשרות 1 גנים, 2, 3. ברמה מתא בודד, ביטוי גנים זמנית קובע האוכלוסייה ההטרוגניות 4, 5. היא מאפשרת את ההבחנה של ההטרוגניות אוכלוסייה על ידי קביעה הוא התמהיל הסביר של שלבי מבשר מגוונים בין תאי בוגרים וגם המגוון של תגובות תא לגירויים.
תאי הלימפה מולדים (ILC) תוארו לאחרונה כאוכלוסייה של effectors מולד של התגובה החיסונית 6, 7. בפרוטוקול זה, ההטרוגניות התא של הוא ILCתא patic נחקר במהלך הומאוסטזיס.
נכון לעכשיו, את הטכניקה הנפוצה ביותר להעריך ביטוי גנים היא RT-qPCR. ביטוי גני אמצעי שיטה זו רק גן אחד בכל פעם. בנוסף, שיטה זו אינה יכולה להעריך ההטרוגניות של ביטוי גנים, מאז מספר תאים נדרשים עבור מבחן אחד. זה מוביל את המדידה של ביטוי גנים הממוצע של האוכלוסייה. בהערכת מספר גדול של גנים, RT-qPCR הופך הזמן-, reagent-, ושיטת רב-המדגם. לפיכך, את יחסי הגומלין להגביל את מספר גנים או אוכלוסיות תאים כי ניתן להעריך, מעלה את הסיכון של חסר בתמונה הגלובלית.
כתב יד זה מתאר כיצד זמנית תא בודד RT-qPCR ניתן להשתמש כדי להתגבר על המגבלות האלה. טכניקה זו נהנתה התקדמות טכנולוגית מיקרופלואידיקה האחרונה 1, 2. תגובות המתרחשות זמנית שבבי RT-qPCR לא EXCeed ברמת nanoliter. לפיכך, ביטוי גני תא בודד, כמו גם ביטוי גנים מרובה בו זמנית, ניתן לבצע בתוך reagent-, sample-, ואופן חסכוני. אפשר לבדוק ההטרוגניות חתימת גן התא ברמה המשובטת בין תת תא בתוך אוכלוסייה בשלבי התפתחותיים שונים או בתנאים שונים 4, 5. עבודה על אוכלוסיות נדירות עם מספר גדול של תנאים ברמה מהתא הבודד הוא כבר לא מגבלה.
Introduction
במהלך השנים האחרונות, תאי הלימפה מולד (ILCs) נחקרו יותר ויותר. למרות חוסר קולטנים אנטיגן ספציפי, הם שייכים שושלת הלימפה ולייצג זקיפים חשובים הומאוסטזיס לרקמות ודלקת. ILCs כיום מחולקים לשלוש קבוצות על בסיס הביטוי שלהם שילובים גורם שעתוק ספציפיים על יכולתם לייצר ציטוקינים 6, 7.
ILCs מובילים למצבים ההומיאוסטטית ו pathophysiological רבים באיברים מגוונים באמצעות ציטוקינים ספציפיים ייצור 8, 9. כדי להיות מסוגל להבין את התפקיד של תאים אלה, חשוב לקבוע את תת-אוכלוסיות ILC השונות לכל איבר ולזהות קשרי ההתפתחות שלהם. בנוסף, תופעות של פלסטיות בין תת השונים נקשרו. על ידי לימוד הטרוגניותשל תאים הנמצאים איבר אחד, אפשר לתחום הבמה של התבגרות שלהם להבחין הפונקציות הספציפיות שלהם.
כדי להמחיש את הטכניקה של תא בודד זמנית RT-qPCR, ILCs הכבד נבחר, עם דגש מיוחד על ההטרוגניות שלהם בתוך אותה קבוצת ILC (סוג 1 ILC) 10. ראשית, באמצעות שימוש cytometry זרימה, שלוש אוכלוסיות ILC ברורים התאפיינו בכבד. הקבוצה 1 ILC מייצג כ 80% של effectors הטבעי תוך שתי האוכלוסיות האחרות הן אוכלוסיות ILC כבדות נדירות (פחות מ -5% של effectors המולדת). אלה אוכלוסיות מוינו באמצעות סמנים על פני קרום התא ביטוי נרחב של אוכלוסיות ILC. כתוצאה מכך, מסודר אוכלוסיות ILC בכבד להסתכל אחד דומה במידה רבה אחר.
זמנית מתא בודד RT-qPCR התפתחה אחת הטכניקות הטובות ביותר כדי לחקור את ההטרוגניות ללא דיחוי על אוכלוסיות אלה 11 </sעד>. שני מאפיינים עיקריים נקבעים על ידי ניצול של טכניקת תא הבודד זמנית RT-qPCR. ראשית, על ידי הסתכלות על רמת המשובטים, אפשר לשחזר ביטוי גנים תא ספציפי להשוואה בין תאים שכנראה להציג שלבי ההתפתחות דומה. לאחר מכן, ע"י הסתכלות שילוב שנבחר מראש של ביטוי גנים, נוכל לקבוע חתימות גן חדשות המבוססת על דפוסי ביטוי גנים בו זמנית בנקודת זמן אחת. היבטים אלה מאפשרים גביית מגוון רחב של נתונים הביטוי עבור מספר גדול של תאים, אפילו על אוכלוסיות נדירות, מאז הטכניקה מבוצעת ברמה המשובטת. ובכך, ההטרוגניות ILC בכבד ניתן להעריך כראוי.
לאחר מכן, על ידי מיון כל התאים עם פנוטיפ עולמי ILC, סקירה רחבה של הביטוי המרובה הגן של האוכלוסיות הכבדות ILC מתקבלת, למרות שהם מייצגים אוכלוסיות נדירות ביותר. שבב מבוסס microfluidic מאפשר התנסות אפילוכמות קטנה של חומר תא. כתוצאה מכך, פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים נדירות ניתן להשיג. באמצעות תוכנת ניתוח חתימת הגן באינטרנט, אשכולות אוכלוסיית תאים ומערכות יחסים תא פוטנציאליים יכולים להיחקר. כתוצאה מכך, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כדי לאמת את נתוני אשכולות ברמת vivo.
עשרות ביטויי גנים ניתן להעריך בו זמנית על מאה או תאים בודדים יותר על אותו השבב 3, 11, 12. עיצוב של assay הוא החלק הארוך ביותר והחשוב ביותר של הניסוי. הקביעה של הגנים הרלוונטיים להשערה להיבדק היא בעל חשיבות עליונה כדי לקבל תוצאות רלוונטיות. שנית, בקרה פנימית (כגון משטח סמנים ידועים הנמצאים בשימוש למיון) ובקרות ספציפיות נדרשות. זה חיוני כדי לבדוק את הספציפיות הגברת פריימר, את היעילות של ההגברה, ו- Tהוא היעדר תחרות פריימר. לכן, עבודה עם רב מפלסי תא בודד RT-qPCR היא טכניקה חיסכון בזמן, כביטוי-גן המרובה של תא נבחן בעת ובעונה האחת.
שימוש באותו שבב ותמהיל ריאגנטים עבור כל התאים מגביל את השגיאות האפשריות של מניפולציה ומאפשר שחזור בין דגימות. בסך הכל, את ההיבטים השונים של תא בודד זמנית RT-qPCR מאפשרים לייצור תוצאות האמינות ביותר ברמה המשובטת, עם רמה גדולה של רגישות למגוון רחב של דוגמאות וגנים. התוצאות שהתקבלו להציע נתונים חזקים ויציבים לבדיקות biostatistical.
זו יכולה להיות מושגת בשל היבט microfluidic של השיטה, המאפשרת עבודה על כמויות קטנות מאוד של חומר ומובילה לתוצאות ממצות. לבסוף, בעזרת תוכנה באופן מקוון, אפשר להשוות את האוכלוסיות הרצויות.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר כיצד להשיג מידע ביטוי גנים ממצה ברמה המשובטת. הנה, חקרנו ההטרוגניות תא כבדות ILC. לאחר מיון תא הבודד של אוכלוסיות ILC שונות (המבוססות על משטח סמני ILC ביטוי נרחב), דגימות מראש מוגברות עבור גנים שנבחרו מראש ספציפיים. לאחר מכן, cDNA ו פריימרים השיג הועמסו על גבי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot and by the Ministère de la Recherche (to S.C.); the Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ”Twothyme” to A.C.); ANR grant ”Myeloten” (to R.G.); and the Institut National du Cancer (Role of the immune microenvironment during liver carcinogenesis, to R.G.). We acknowledge the Center for Human Immunology and Cytometry platform at Institut Pasteur for their support.
Materials
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20X primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20X primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20X primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20X primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20X primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20X primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20X primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20X primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20X primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20X primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20X primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20X primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20X primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20X primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20X primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20X primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20X primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20X primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20X primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20X primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20X primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20X primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20X primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20X primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20X primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20X primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20X primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20X primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20X primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20X primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20X primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20X primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20X primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20X primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20X primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20X primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20X primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20X primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20X primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20X primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20X primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20X primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20X primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20X primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20X primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20X primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20X primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2X Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 mL syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fœtal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 mL tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 mL tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| Facs machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1000 µL tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 mL | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
Referências
- Sun, H., et al. A Bead-Based Microfluidic Approach to Integrated Single-Cell Gene Expression Analysis by Quantitative RT-PCR. RSC Adv. 5, 4886-4893 (2015).
- Kellogg, R. A., Berg, R. G., Leyrat, A. A., Tay, S. High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics. Nat. Protoc. 9 (7), 1713-1726 (2014).
- Moignard, V., Macaulay, I. C., Swiers, G., Buettner, F., Schütte, J. Characterisation of transcriptional networks in blood stem and progenitor cells using high-throughput single cell gene expression analysis. Nat. Cell Biol. 15 (4), 363-372 (2013).
- Chea, S., Schmutz, S., et al. Single-Cell Gene Expression Analyses Reveal Heterogeneous Responsiveness of Fetal Innate Lymphoid Progenitors to Notch Signaling. Cell Rep. 14 (6), 1500-1516 (2016).
- Ishizuka, I. E., Chea, S., et al. Single-cell analysis defines the divergence between the innate lymphoid cell lineage and lymphoid tissue – inducer cell lineage. Nat. Immunol. 17, 1-9 (2016).
- Spits, H., Artis, D., et al. Innate lymphoid cells – a proposal for uniform nomenclature. Nat.Rev. Immunol. 13 (2), 145-149 (2013).
- Walker, J. A., Barlow, J. L., McKenzie, A. N. J. Innate lymphoid cells- how did we miss them. Nat. Rev. Immunol. 13 (2), 75-87 (2013).
- Vallentin, B., Barlogis, V., et al. Innate Lymphoid Cells in Cancer. Cancer Immunol. Res. 3 (10), 1109-1114 (2015).
- Monticelli, L. a., Artis, D. Innate lymphoid cells promote lung tissue homeostasis following acute influenza virus infection. Nat. Immunol. 12 (11), 1045-1054 (2012).
- Tang, L., et al. Differential phenotypic and functional properties of liver-resident NK cells and mucosal ILC1s. J. Autoimmun. 67, 29-35 (2015).
- Durum, K., Gilfillan, S., Colonna, M., Consortium, G. Transcriptional Programs Define Molecular Characteristics of Innate Lymphoid Cell Classes and Subsets. Nat. Immunol. 16 (3), 306-317 (2015).
- Wang, H., Ramakrishnan, A., Fletcher, S., Prochownik, E. V., Genetics, M. Clonal dynamics of native haematopoiesis. Nature. 2 (2), 322-327 (2015).
- Samsa, L. A., Fleming, N., Magness, S., Qian, L., Liu, J. Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (109), e1-e10 (2016).
- Klose, C., Flach, M., et al. Differentiation of Type 1 ILCs from a Common Progenitor to All Helper-like Innate Lymhpoid Cell Lineages. Cell. 157, 340-356 (2014).
- Dicle, Y., et al. Bioinformatics Approaches to Single-Cell Analysis in Developmental Biology. MHR. 22, 182-192 (2016).
- Setty, M., et al. Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from single-cell data. Nat Biotechnol. 34, 637-645 (2016).
